ערכת Cell Direct RT qPCR—SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell ערכות qRT-PCR שלב אחד
תיאורים
ערכה זו משתמשת במערכת חיץ תמוגה ייחודית שיכולה לשחרר במהירות RNA מדגימות תאים מתורבתות לתגובות RT-qPCR, ובכך לחסל את תהליך טיהור ה-RNA שגוזל זמן רב ומייגע.ניתן להשיג את תבנית ה-RNA תוך 7 דקות בלבד.ה-5×ישיר RT Mix ו-2×ריאגנטים ישירים של qPCR Mix-SYBR המסופקים על ידי הערכה יכולים להשיג במהירות וביעילות תוצאות PCR כמותיות בזמן אמת.
5×ישיר RT Mix ו-2×ל-Direct qPCR Mix-SYBR יש סבילות מעכבת חזקה, וה-lysate של הדגימות יכול לשמש כתבנית עבור RT-qPCR ישירות.ערכה זו מכילה את ה-RNA הייחודי בעל זיקה גבוהה Foregene transcriptase הפוכה, ו-Hot D-Taq DNA פולימראז, dNTPs, MgCl2, חוצץ תגובה, מייעל PCR ומייצב.
מפרטים
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
רכיבי ערכה
| חלק א' | Buffer CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Buffer ST | |
| חלק שני | מחק DNA |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX Reference Dye | |
| ddH2O ללא RNase | |
| הוראות | |
תכונות ויתרונות
■פשוט ויעיל: עם טכנולוגיית Cell Direct RT, ניתן לקבל דגימות RNA תוך 7 דקות בלבד.
■ הדרישה לדגימה קטנה, ניתן לבדוק עד 10 תאים.
■ תפוקה גבוהה: הוא יכול לזהות במהירות RNA בתאים שתרביתו בצלחות של 384, 96, 24, 12, 6-בארים.
■ DNA Eraser יכול להסיר במהירות גנומים משוחררים, להפחית מאוד את ההשפעה על תוצאות הניסוי הבאות.
■ מערכת RT ו-qPCR אופטימלית הופכת את התעתוק האחורי דו-שלבי RT-PCR ליעיל יותר ול-PCR ספציפי יותר, ועמיד יותר בפני מעכבי תגובה RT-qPCR.
יישום ערכה
היקף היישום: תאים בתרבית.
- RNA משוחרר על ידי תמוגה מדגימה: ישים רק לתבנית RT-qPCR של ערכה זו.
- הערכה יכולה לשמש למטרות הבאות: ניתוח ביטוי גנים, אימות אפקט השתקת גנים בתיווך siRNA, בדיקת תרופות וכו'.
תרשים
אחסון וחיי מדף
יש לאחסן את חלק I של ערכה זו בטמפרטורה של 4℃;יש לאחסן את החלק השני ב-20℃.
יש לאחסן את Foregene Protease Plus II ב-4℃, אין להקפיא ב-20 ℃.
ריאגנט 2×יש לאחסן את Direct qPCR Mix-SYBR ב -20℃בחושך;אם משתמשים בו לעתים קרובות, ניתן לאחסן אותו גם ב-4℃ לאחסון לטווח קצר (השתמש תוך 10 ימים).
עקרונות עיצוב פריימר בזמן אמת PCR
פריימר קדימה ופרימר לאחור
עבור PCR בזמן אמת, עיצוב פריימר חשוב מאוד.פריימרים קשורים לספציפיות וליעילות של הגברה של PCR, וניתן לעצב אותם תוך התייחסות לעקרונות הבאים:
אורך פריימר: 18-30bp.
תכולת GC: 40-60%.
ערך Tm: תוכנת עיצוב פריימר, כמו Primer 5, יכולה לתת את ערך ה-Tm של הפריימר.ערכי ה-Tm של הפריימרים במעלה הזרם והמורד הזרם צריכים להיות קרובים ככל האפשר.ניתן להשתמש גם בנוסחת חישוב Tm: Tm = 4°C (G + C) + 2°C (A + T).בעת ביצוע PCR, טמפרטורה מתחת לערך ה-primer Tm של 5 מעלות צלזיוס נבחרת בדרך כלל כטמפרטורת החישול (העלייה המקבילה בטמפרטורת החישול יכולה להגביר את הספציפיות של תגובת ה-PCR).
פריימרים ומוצרי PCR:
אורך המוצר להגברת PCR של פריימר עיצוב הוא רצוי 100-150bp.
יש להימנע ככל האפשר מפריי תכנון באזור המבני המשני של התבנית.
הימנע מהיווצרות של 2 או יותר בסיסים משלימים בין קצוות 3′ של פריימרים במעלה הזרם ומורד הזרם.
בסיס מסוף פריימר 3′ לא יכול להיות קיים עם 3 נוספים G או C רצופים.
לפריימרים עצמם לא יכולים להיות מבנים משלימים, אחרת יווצר מבנה סיכת ראש, המשפיע על הגברה של PCR.
יש לפזר את ATCG בצורה שווה ככל האפשר ברצף ה-primer, ויש להימנע מהבסיס המסוף של 3′ כ-T.
נספח 1: חבילת תוספת רכיבי ערכת Cell Direct RT-qPCR
1.תמיסת ליטוש תאים
|
| |||
| רכיבי ערכה (מערכת תמוגה / באר 24 באר) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| חֵלֶקאני | Buffer CL | 20 מ"ל | 100 מ"ל |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 מ"ל × 2 | |
| Buffer ST | 1 מ"ל × 2 | 10 מ"ל | |
| חֵלֶקII | מחק DNA | 400 μl | 1 מ"ל × 2 |
2.RT מיקס
|
| |
| רכיבי ערכה (מערכת תגובה של 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| ddH ללא RNase2O | 1.7 מ"ל × 2 |
|
| ||
| רכיבי ערכה (מערכת תגובה של 20 μl) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 מ"ל × 2 | 1.7 מ"ל × 6 |
| 50× ROX Reference Dye | 40 μl | 200 μl |
| ddH ללא RNase2O | 1.7 מ"ל | 10 מ"ל |
מדריכי הוראות:
