אין אותות הגברה

1. ה-Taq DNA Polymerase בערכה מאבד את פעילותו עקב אחסון לא תקין או פקיעת תוקף של הערכה.
המלצה: אשר את תנאי האחסון של הערכה;הוסף מחדש כמות מתאימה של Taq DNA Polymerase למערכת ה-PCR או רכוש ערכת PCR חדשה בזמן אמת לניסויים קשורים.

2.יש הרבה מעכבים של Taq DNA Polymerase בתבנית ה-DNA.
הצעה: טהר מחדש את התבנית או צמצם את כמות התבנית שבה נעשה שימוש.

3. ריכוז Mg2+ אינו מתאים.
המלצה: ריכוז Mg2+ של 2× Real PCR Mix שאנו מספקים הוא 3.5mM.עם זאת, עבור כמה פריימרים ותבניות מיוחדים, ריכוז Mg2+ עשוי להיות גבוה יותר.לכן, אתה יכול להוסיף ישירות MgCl2 כדי לייעל את ריכוז Mg2+.מומלץ להגדיל את Mg2+ 0.5mM בכל פעם לצורך אופטימיזציה.

4. תנאי ההגברה של PCR אינם מתאימים, ורצף הפריימר או הריכוז אינם מתאימים.
הצעה: אשר את נכונות רצף הפריימר והפריימר לא הושפל;אם אות ההגברה אינו טוב, נסה להוריד את טמפרטורת החישול ולהתאים את ריכוז הפריימר כראוי.

5.כמות התבנית קטנה מדי או גדולה מדי.
המלצה: בצע דילול שיפוע ליניאריזציה של תבנית, ובחר את ריכוז התבנית עם אפקט ה-PCR הטוב ביותר עבור ניסוי PCR בזמן אמת.

ל-NTC יש ערך פלואורסצנטי גבוה מדי

1. זיהום ריאגנט שנגרם במהלך הפעולה.
המלצה: החלף בריאגנטים חדשים עבור ניסויי PCR בזמן אמת.

2. זיהום התרחש במהלך הכנת מערכת התגובה PCR.
המלצה: לנקוט באמצעי הגנה נדרשים במהלך הפעולה, כגון: לבישת כפפות לטקס, שימוש בקצה פיפטה עם פילטר וכו'.

3. הפריימרים מתכלים, והפירוק של הפריימרים יגרום להגברה לא ספציפית.
הצעה: השתמש באלקטרופורזה של SDS-PAGE כדי לזהות אם הפריימרים מתכלים, והחליפו אותם בפריימרים חדשים לניסויי PCR בזמן אמת.

פריימר דימר או הגברה לא ספציפית

1. ריכוז Mg2+ אינו מתאים.
המלצה: ריכוז Mg2+ של 2× Real PCR EasyTM Mix שאנו מספקים הוא 3.5 mM.עם זאת, עבור כמה פריימרים ותבניות מיוחדים, ריכוז Mg2+ עשוי להיות גבוה יותר.לכן, אתה יכול להוסיף ישירות MgCl2 כדי לייעל את ריכוז Mg2+.מומלץ להגדיל את Mg2+ 0.5mM בכל פעם לצורך אופטימיזציה.

2. טמפרטורת החישול של PCR נמוכה מדי.
הצעה: הגדל את טמפרטורת החישול PCR ב-1 ℃ או 2 ℃ בכל פעם.

3. מוצר ה-PCR ארוך מדי.
המלצה: אורך מוצר ה-PCR בזמן אמת צריך להיות בין 100-150bp, לא יותר מ-500bp.

4. הפריימרים מתכלים, והפירוק של הפריימרים יוביל להופעת הגברה ספציפית.
הצעה: השתמש באלקטרופורזה של SDS-PAGE כדי לזהות אם הפריימרים מתכלים, והחליפו אותם בפריימרים חדשים לניסויי PCR בזמן אמת.

5. מערכת ה-PCR אינה תקינה, או שהמערכת קטנה מדי.
הצעה: מערכת תגובת PCR קטנה מדי תגרום לירידה בדיוק הזיהוי.עדיף להשתמש במערכת התגובה המומלצת על ידי מכשיר ה-PCR הכמותי כדי להפעיל מחדש את ניסוי ה-PCR בזמן אמת.

יכולת חזרה לקויה של ערכים כמותיים

1. המכשיר לא תקין.
הצעה: ייתכנו שגיאות בין כל חור PCR של המכשיר, וכתוצאה מכך לשחזור לקוי במהלך ניהול טמפרטורה או זיהוי.אנא בדוק בהתאם להוראות של המכשיר המתאים.

2. טוהר המדגם אינו טוב.
המלצה: דגימות לא טהורות יובילו לשחזור לקוי של הניסוי, הכולל את טוהר התבנית והפריימרים.עדיף לטהר מחדש את התבנית, והפריימרים מטוהרים בצורה הטובה ביותר על ידי SDS-PAGE.

3. זמן ההכנה והאחסון של מערכת PCR ארוך מדי.
הצעה: השתמש במערכת PCR בזמן אמת לניסוי PCR מיד לאחר ההכנה, ואל תשאיר אותה בצד יותר מדי זמן.

4. תנאי ההגברה של PCR אינם מתאימים, ורצף הפריימר או הריכוז אינם מתאימים.
הצעה: אשר את נכונות רצף הפריימר והפריימר לא הושפל;אם אות ההגברה אינו טוב, נסה להוריד את טמפרטורת החישול ולהתאים את ריכוז הפריימר כראוי.

5. מערכת ה-PCR אינה תקינה, או שהמערכת קטנה מדי.
הצעה: מערכת תגובת PCR קטנה מדי תגרום לירידה בדיוק הזיהוי.עדיף להשתמש במערכת התגובה המומלצת על ידי מכשיר ה-PCR הכמותי כדי להפעיל מחדש את ניסוי ה-PCR בזמן אמת.