1. הבנה ראשונית

בשלב זה, עלינו להבין כמה מושגים ומינוחים, כדי להימנע מטעויות מול הקשישים שלנו, כגון:

ש: מה ההבדל בין RT-PCR, qPCR, PCR בזמן אמת ו-RT-PCR בזמן אמת?

תשובה: RT-PCR הוא PCR שעתוק לאחור(שעתוק הפוך PCR, RT-PCR), שהוא גרסה בשימוש נרחב של תגובת שרשרת פולימראז (PCR).ב-RT-PCR, גדיל RNA מועתק לאחור ל-DNA משלים, המשמש לאחר מכן כתבנית להגברת DNA על ידי PCR.
בזמן אמת-PCR ו-qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) הם אותו הדבר, שניהם הם PCR כמותי בזמן אמת, כלומר לכל מחזור של PCR יש רשומות נתונים בזמן אמת, כך שניתן להתאים את מספר התבניות ההתחלתיות בניתוח מדויק.

למרות שנראה כי גם PCR בזמן אמת (PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת) וגם PCR בשעתוק הפוך (PCR בשעתוק הפוך) מקוצרים כ-RT-PCR, האמנה הבינלאומית היא: RT-PCR מתייחס ספציפית לתעתוק הפוך.PCR, PCR בזמן אמת מקוצר בדרך כלל כ-qPCR (PCR כמותי בזמן אמת).

ו-RT-PCR בזמן אמת (RT-qPCR), זהו ה-PCR לשעתוק הפוך בשילוב עם הטכנולוגיה הכמותית הפלורסנטית: תחילה השג cDNA (RT) משעתוק הפוך של RNA, ולאחר מכן השתמש ב-PCR בזמן אמת לניתוח כמותי (qPCR).רוב המעבדות עושות RT-qPCR, כלומר מחקר על הורדת ויסות ביטוי RNA, כך שה-qPCR שכולם מדברים עליו במעבדה מתייחס למעשה ל-RT-qPCR, אבל אל תשכחו שעדיין יש הרבה בדיקות DNA ביישומים קליניים.ניתוח כמותי, כגון זיהוי HBV של וירוס הפטיטיס B.

שאלה: לאחר קריאת PCR כמותי פלואורסצנטי, מדוע יש לשלוט על המקטע המוגבר בטווח של 80-300bp?

תשובה: האורך של כל רצף גנים שונה, חלקם הם כמה קילו-ביטים, חלקם מאות ב-p, אך אנו צריכים רק לדרוש שאורך המוצר יהיה 80-300bp בעת תכנון פריימרים, קצרים מדי או ארוכים מדי אינם מתאימים לזיהוי PCR כמותי פלואורסצנטי.קטע המוצר קצר מכדי להבחין בין הפריימר-דימר.אורכו של הפריימר-דימר הוא כ-30-40bp, וקשה להבחין אם מדובר בפריימר-דימר או במוצר אם הוא פחות מ-80bp.אם קטע המוצר ארוך מדי, עולה על 300bp, זה יוביל בקלות ליעילות הגברה נמוכה ולא יכול לזהות ביעילות את כמות הגן.

לדוגמה, כאשר אתה סופר כמה אנשים יש בכיתה, אתה רק צריך לספור כמה פיות יש.הדבר נכון כאשר אתה מזהה גנים, אתה רק צריך לזהות רצף מסוים של גן כדי לייצג את הרצף כולו.אם אתה רוצה לספור אנשים, אתה צריך לספור גם פיות וגם אפים, אוזניים וגם משקפיים, וקל לעשות טעויות.

להרחבה, במחקר ביולוגי, ישנם מקרי מחקר רבים מנקודה לאזור, מכיוון שרצף הגנים של כל מין הוא ארוך מאוד, מיותר ובלתי אפשרי למדוד את כל הפרגמנטים, כגון רצף 16S של חיידקים, כלומר לבצע את הרצף השמרני של מבחני חיידקים כדי להסיק את מספר אוכלוסייה מסוימת של חיידקים.

ש: מהו האורך האופטימלי עבור עיצוב פריימר qPCR?

תשובה: באופן כללי, אורך הפריימר הוא בערך 20-24bp, וזה עדיף.כמובן שעלינו לשים לב לערך ה-TM של הפריימר בעת תכנון הפריימר, כי זה קשור לטמפרטורת החישול האופטימלית.לאחר הרבה ניסויים, הוכח ש-60°C הוא ערך TM טוב יותר.אם טמפרטורת החישול נמוכה מדי, זה יוביל בקלות להגברה לא ספציפית.אם טמפרטורת החישול גבוהה מדי, יעילות ההגברה תהיה נמוכה יחסית, שיא עקומת ההגברה יתחיל מאוחר יותר וערך ה-CT יתעכב.

ש: במה שונה שיטת הצביעה משיטת הבדיקה?

תשובה: שיטת צבעחלק מהצבעים הפלורסנטיים, כגון SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO וכו', אינם פולטים אור בעצמם, אך יפלטו פלואורסצנטיות לאחר היצמדות לחריץ הקטן של DNA דו-גדילי.לכן, בתחילת תגובת ה-PCR, המכונה לא יכולה לזהות את האות הפלורסנט.כאשר התגובה מגיעה לשלב החישול-הארכת, הגדיל הכפול נפתח, וגדיל חדש מסונתז בפעולת ה-DNA פולימראז, והמולקולה הפלורסנטית נקשרת לחריץ הקטן dsDNA.ככל שמספר מחזורי ה-PCR גדל, יותר ויותר צבעים משולבים עם דנ"א דו-גדילי, וגם האות הפלורסנטי משתפר באופן מתמיד.שיטת הצביעה משמשת בעיקר במחקר מדעי.
נ.ב.: היזהר בעת ביצוע הניסוי, הצבע צריך להיות משולב עם DNA אנושי, הקפד להפוך אותו לאדם ניאון.

שיטת צבע (משמאל) שיטת בדיקה (ימין)
נ.ב.: היזהר בעת ביצוע הניסוי, הצבע צריך להיות משולב עם DNA אנושי, הקפד להפוך אותו לאדם ניאון.

SYBR Green Ⅰ נקשר לחריץ הקטן של ה-DNA

שיטת בדיקהבדיקה של טקמן היא בדיקה הידרוליזה הנפוצה ביותר.ישנה קבוצה פלואורסצנטית בקצה 5' של הבדיקה, בדרך כלל FAM, והבדיקה עצמה היא רצף משלים לגן המטרה.יש קבוצת מרווה פלואורסצנטי בקצה 3′.על פי העיקרון של העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (Förster resonance energy transfer, FRET), כאשר קבוצת הפלורסנט הכתבת (מולקולת פלואורסצנטי תורמת) וקבוצת הפלורסנט המכווה (מולקולת פלואורסצנטית המקובלת) מתרגשות כאשר הספקטרום חופף והמרחק קרוב מאוד של הקופסה של הפלואורנס (7-10) מולקולת המקבל, בעוד האוטופלואורסצנטי נחלש.לכן, בתחילת תגובת ה-PCR, כאשר הפרוב פנוי ושלם במערכת, קבוצת הפלורסנט המדווחת לא תפלוט פלואורסצנטיות.בעת חישול, הפריימר והפרוב נקשרים לתבנית.בשלב ההארכה, הפולימראז מסנתז באופן רציף שרשראות חדשות.ל-DNA פולימראז פעילות 5'-3' exonuclease.כאשר יגיעו לבדיקה, ה-DNA פולימראז יבצע הידרוליזה של הבדיקה מהתבנית, יפריד את קבוצת הפלורסנט הכתב מקבוצת הפלורסנט המרווה וישחרר את האות הפלואורסצנטי.מאחר וקיים קשר אחד לאחד בין הבדיקה לתבנית, שיטת הבדיקה עדיפה על שיטת הצביעה מבחינת הדיוק והרגישות של הבדיקה.שיטת הבדיקה משמשת בעיקר באבחון.

ש: מהו כימות מוחלט?מהו כימות יחסי?

תשובה: כימות מוחלט מתייחס לחישוב מספר העותק הראשוני של הדגימה שתיבדק על ידי qPCR, כגון כמה נגיפי HBV יש ב-1 מ"ל של דם.התוצאה המתקבלת בכימות יחסי היא השינוי בכמות גן המטרה בדגימה ספציפית ביחס לדגימת ייחוס אחרת, וביטוי הגנים מווסת למעלה או מטה.

ש: האם כמות מיצוי ה-RNA, יעילות השעתוק הפוכה ויעילות ההגברה ישפיעו על תוצאות הניסוי?
ש: האם אחסון דגימות, ריאגנטים לחילוץ, ריאגנטים לשעתוק הפוך וחומרים מתכלים מעבירי אור ישפיעו על תוצאות הניסוי?
ש: איזו שיטה יכולה לתקן את נתוני הניסוי?

לגבי נושאים אלו, נתאר אותם בפירוט בסעיפים המתקדמים והמתקדמים להלן.
2. ידע מתקדם

בכל הנוגע ל-PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת, עלינו להכיר במציאות שבה מתפרסמים אלפי מאמרי מחקר מדעיים מדי שנה, ביניהם טכנולוגיית ה-PCR הכמותית הפלורסנטית אינה מספר קטן.

אם אין תקן משותף למדידת ניסוי PCR כמותי פלואורסצנטי, התוצאות עשויות להשתנות במידה רבה.עבור אותו גן מאותו מין, עם אותה שיטת עיבוד, גם תוצאות הזיהוי ישתנו במידה רבה, ויהיה קשה למאחרים לחזור על אותן תוצאות.אתה אף אחד לא יודע מה נכון ומה לא נכון.

האם זה אומר ש-PCR כמותי פלואורסצנטי הוא טכנולוגיית רמאות או טכנולוגיה לא אמינה?לא, זה בגלל ש-PCR כמותי פלואורסצנטי רגיש יותר ומדויק יותר, וקצת שגויה תניב תוצאות הפוכות לחלוטין.הפסד קטן נמצא במרחק של אלף קילומטרים.כותב המאמר עלול להיות עונה שוב ושוב על ידי הסוקרים.יחד עם זאת, לסוקר כתב העת קשה לבחור מבין תוצאות ניסוי שונות.

בסך הכל, מצביע על חוסר קונצנזוס בניסויי PCR בזמן אמת.לשם כך החלו מדענים בכירים בתעשייה לגבש סטנדרטים,דרישה מהתורמים לספק כמה פרטי ניסויים ועיבוד נתונים הכרחיים (כולל נתונים נחוצים) במאמר כדי לעמוד בסטנדרטים הללו.

סוקרים יכולים לשפוט את איכות הניסוי על ידי קריאת פרטים אלה;קוראים עתידיים יכולים להשתמש בזה גם כדי לחזור על הניסוי או לשפר את הניסוי.ואז תוצאות הניסוי המתקבלות בדרך זו מלאות במידע, איכותיות ושמישות.

MIBBI (מידע מינימלי לחקירות ביולוגיות וביו-רפואיות -http://www.mibbi.org) הפך להיות.MIBBI הוא פרויקט המספק סטנדרטים לניסויים.זה מתפרסם בטבע.פרויקט זה מכוון לניסויים ביולוגיים שונים, כולל ביולוגיה של התא, Microarray, qPCR שעליו נדון כעת וכו', ומספק כל סוג של ניסוי בעת הגשת כתבי יד.מידע זה צריך להיות מסופק בכל עת.

בפרויקט MIBBI, ישנם שני מאמרים הקשורים ל-PCR כמותי פלואורסצנטי, כלומר:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - מדריך שפה ודיווח מובנה לנתוני PCR כמותיים בזמן אמת;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – מידע מינימלי לפרסום מאמרים על ניסויי PCR כמותיים בזמן אמת.
ראשית, בואו נדבר על RDML, מפרט הטרמינולוגיה.

אם אין הגדרה תקנית לכל דבר, אי אפשר להמשיך את הדיון, ולכן הסבר המונחים כל כך חשוב בבחינה.
המינוח המשמש בניסוי PCR כמותי פלואורסצנטי כולל את התוכן הבא.QIAGEN הכינה עבורנו את הסיכום הטוב ביותר.הכלים הבאים יבשיםסְחוֹרוֹת .

עקומת הגברה
עקומת ההגברה מתייחסת לעקומה שנעשתה במהלך תהליך ה-PCR, כאשר מספר המחזור הוא האבססיס ועוצמת הקרינה בזמן אמת במהלך התגובה כאורדינאטה.

עקומת הגברה מצוינת צריכה להיות בעלת המאפיינים הבאים: קו הבסיס שטוח או מעט ירד, ואין מגמת עלייה ברורה;נקודת הפיתול של העקומה ברורה, והשיפוע של השלב האקספוננציאלי פרופורציונלי ליעילות ההגברה.ככל שהשיפוע גדול יותר, כך יעילות ההגברה גבוהה יותר;עקומת ההגברה הכוללת ההקבלה טובה, מה שמעיד על כך שיעילות ההגברה של כל צינור דומה;השלב האקספוננציאלי של עקומת ההגברה של דגימות בריכוז נמוך ברור.

קו בסיס (קו בסיס)
קו הבסיס הוא רמת הרעש של המחזור המוקדם, נמדד בדרך כלל בין המחזור ה-3 ל-15, מכיוון שלא ניתן לזהות את עליית ערך הקרינה הנגרמת על ידי תוצר ההגברה במהלך תקופה זו.מספר המחזורים המשמשים לחישוב קו הבסיס יכול להיות שונה וייתכן שיהיה צורך להפחיתו אם נעשה שימוש בכמויות תבנית גבוהות או אם רמת הביטוי של גן היעד גבוהה.

הגדרת קו הבסיס דורשת צפייה בנתוני הקרינה מעקומת ההגברה הליניארית.קו הבסיס נקבע כך שהצמיחה של עקומת ההגברה מתחילה במספר מחזור גדול ממספר המחזור העליון של קו הבסיס.יש להגדיר את קווי הבסיס בנפרד עבור כל רצף יעד.יש להפחית את ערכי הקרינה הממוצעים שזוהו במחזורים המוקדמים מערכי הקרינה המתקבלים במוצרים המוגברים.הגרסאות האחרונות של תוכנות PCR שונות בזמן אמת מאפשרות אופטימיזציה אוטומטית של הגדרות הבסיס עבור דגימות בודדות.

במהלך המחזורים הראשונים של תגובת ההגברה של PCR, אות הקרינה לא משתנה הרבה.התקרבות לקו ישר נקראת קו הבסיס, אבל אם נסתכל מקרוב על המחזורים הראשונים, נראה שבתוך קו הבסיס נמצא מה שקורה בתמונה למטה.

רקע רקע מתייחס
ערך הקרינה הלא ספציפי בתגובה.לדוגמה: מרווה קרינה לא יעיל;או מספר רב של תבניות DNA דו-גדיליות עקב השימוש ב-SYBR Green.רכיבי הרקע של האות מוסרים מתמטית על ידי אלגוריתם תוכנת PCR בזמן אמת.

אות כתב
אות כתב מתייחס לאות הניאון שנוצר על ידי SYBR Green או בדיקות רצף ספציפיות עם תווית ניאון במהלך PCR בזמן אמת.

אות כתב מנורמל (RN)
RN מתייחס לעוצמת הקרינה של צבע הכתב חלקי עוצמת הקרינה של צבע הייחוס הפסיבי הנמדד בכל מחזור.

צבע התייחסות פסיבי
בחלק מה-PCR בזמן אמת,צבע הפלורסנט ROX משמש כהתייחסות פנימית לנרמל את האות הפלורסנטי.זה מתקן וריאציות עקב פיפטציה לא מדויקת, מיקום הבאר ותנודות הקרינה על בסיס טוב אחר באר.

סף הקרינה (סף)
הותאם מעל ערך הרקע ובאופן משמעותי מתחת לערך הרמה של עקומת ההגברה.הוא חייב לשכב באזור הליניארי של עקומת ההגברה, המייצג את הטווח הלוג-ליניארי של זיהוי PCR.יש להגדיר ספים בתצוגת עקומת ההגברה הלוגית כך שניתן יהיה לזהות בקלות את השלב הלוג-ליניארי של PCR.אם יש מספר גנים מטרה ב-PCR בזמן אמת, יש להגדיר את הסף עבור כל יעד.בדרך כלל, אות הקרינה של 15 המחזורים הראשונים של תגובת PCR משמש כאות רקע הקרינה, וסף הקרינה הוא פי 10 סטיית התקן של אות הקרינה של 3 עד 15 המחזורים הראשונים של PCR, וסף הקרינה נקבע בשלב ההגברה של PCR.באופן כללי, לכל מכשיר מוגדר סף הקרינה שלו לפני השימוש.

סף מחזור (CT) או נקודת מעבר (CP)
המחזור שבו עקומת ההגברה חוצה את הסף (כלומר, הנקודה שבה גילוי הקרינה עולה באופן משמעותי).CT יכול להיות חלק וניתן לחשב את כמות התבנית ההתחלתית.ערך ה-CT מייצג את מספר המחזורים שחווים כאשר האות הפלורסנט בכל צינור תגובה PCR מגיע לסף שנקבע.קיים קשר ליניארי בין ערך ה-CT של כל תבנית ללוגריתם של מספר העותק הראשוני של התבנית, ה-מספר העותק הראשוני גבוה יותר, כך ערך ה-CT קטן יותר, ולהיפך.ניתן ליצור עקומה סטנדרטית באמצעות תקן עם מספר העתק התחלתי ידוע, שבו האבשיסה מייצגת את ערך ה-CT, והאורדינאטה מייצגת את הלוגריתם של מספר ההעתקה הראשוני.לכן, כל עוד מתקבל ערך ה-CT של הדגימה הלא ידועה, ניתן לחשב את מספר ההעתק הראשוני של הדגימה מהעקומה הסטנדרטית.

ערך ΔCT
ערך ΔCT מתארההבדל בין גן המטרה לבין ערך ה-CT של גן הייחוס האנדוגני המתאים, כגון גן משק בית, ומשמש לנרמל את כמות התבנית שבה נעשה שימוש:
⇒ΔCT = CT (גן מטרה) - CT (גן התייחסות אנדוגני)

ערך ΔΔCT
ערך ΔΔCT מתאר את ההבדל בין ערך ה-ΔΔCT הממוצע של דגימה מעניינת (למשל, תאים מגורים) לבין ערך ΔΔCT הממוצע של דגימת ייחוס (למשל, תאים לא מגורים).דגימת הייחוס נקראת גם דגימת הכיול וכל שאר הדגימות מנורמלות לזה לשם כימות יחסי:
⇒ΔΔCT = ΔCT ממוצע (דגימת עניין) - ΔCT ממוצע (מדגם ייחוס)

גני התייחסות אנדוגניים (גנים התייחסות אנדוגניים)
רמות הביטוי של גנים להתייחסות אנדוגניים, כגון גנים לניהול משק בית (גנים לניהול משק בית), אינן שונות בין הדגימות.השוואת ערכי ה-CT של גן ההתייחסות לגן המטרה מאפשרת לנרמל את רמת הביטוי של גן המטרה לכמות ה-RNA הקלט או ה-cDNA (ראה סעיף על ערכי ΔCT לעיל).

גנים להתייחסות פנימית נכונים עבורפירוק אפשרי של RNA או נוכחות של מעכבי אנזים בדגימות RNA, כמו גם שינויים בתכולת ה-RNA, יעילות שעתוק הפוכה, התאוששות חומצת גרעין וטיפול בדגימות.כדי לבחור את גן ההתייחסות האופטימלי, שינינו את האלגוריתם כדי לאפשר את בחירת ההתייחסות האופטימלית בהתאם להגדרת הניסוי.

שליטה פנימית
רצף בקרה המוגבר באותה תגובה כמו רצף המטרה ונבדק עם בדיקה אחרת (כלומר, ביצוע דופלקס PCR).לעתים קרובות נעשה שימוש בבקרות פנימיות כדי לשלול הגברות כושלות, כגון כאשר רצף המטרה אינו מזוהה.
דגימת כיול
דגימת ייחוס (לדוגמה, RNA מטוהר מקו תאים או רקמה) המשמשת בכימות יחסית כדי להשוות את כל הדגימות האחרות כדי לקבוע את רמת הביטוי היחסית של גן.דגימת הכיול יכולה להיות כל דגימה, אבל היא בדרך כלל בקרה (לדוגמה, דגימה לא מטופלת או דגימה מזמן אפס של הניסוי).

בקרות חיוביות
להשתמש בתגובות בקרה עםכמויות ידועות של תבנית.לעתים קרובות נעשה שימוש בבקרות חיוביות כדי לבדוק שסט פריימר או סט פריימר-probe פועלים כראוי ושהתגובה מוגדרת כהלכה.

אין בקרת תבנית (NTC)
תגובת בקרה המכילה את כל המרכיבים הדרושים לתגובת ההגברה מלבד התבנית, שבדרך כלל מוחלפת במים.השימוש ב-NTC יכול למצוא את הזיהום שנגרם על ידי זיהום מגיב או DNA זר, ובכך להבטיח את האותנטיות והאמינות של נתוני הזיהוי.הגברה של בקרת NTC מצביעה על זיהום.

אין בקרת RT (NRT)
תהליך מיצוי RNA עשוי להכיל שיורי DNA גנומי, שהוא מזיק ביותר והוא האשם המשפיע על איכות הנתונים והאויב הטבעי של qPCR, ולכן בעת ​​תכנון ניסויים, הוא חייב להיות מתוכנן להגביר רק את זיהוי ה-RNA.ישנן שתי דרכים, האחת היא לעצב פריימרים על פני אינטרונים, השנייה היא להסיר לחלוטין DNA, איזו מהן טובה יותר, עליה נדון בהמשך.בקרת ה-NTR היא מראה קסם לזיהוי זיהום DNA.אם יש הגברה, זה אומר שיש זיהום.

תקנים
תקנים הם דוגמאות של ריכוז ידוע או מספר העתקה המשמשים לבניית עקומה סטנדרטית.על מנת להבטיח את יציבות התקן, משובטים לרוב את קטע הגן לתוך הפלסמיד ומשמשים אותו כסטנדרט.

העקומה הסטנדרטית
מדולל בדרך כלל ל-5 שיפועים ריכוזיים לפחות עם התוצר הסטנדרטי לפי יחס ההכפלה, ומציירים 5 נקודות בקואורדינטות של ערך CT ומספר העתק, והנקודות מחוברות ליצירת קו ליצירת עקומה סטנדרטית.עבור כל עקומה סטנדרטית, יש לבדוק את תקפותה.ערך השיפוע נופל בין -3.3 ל -3.8, וכל ריכוז מבוצע בשלושה עותקים.יש למחוק נקודות ששונות באופן משמעותי מנקודות אחרות.ערך ה-CT של הדגימה הנבדקת מובא לעקומה הסטנדרטית, וניתן לחשב את רמת הביטוי של הדגימה הנבדקת.

ערך ה-CT של הדגימה הנבדקת מובא לעקומה הסטנדרטית, וניתן לחשב את מספר העותק הראשוני של הדגימה הנבדקת.

יעילות ושיפוע
השיפוע של העקומה הסטנדרטית מייצג את היעילות של PCR בזמן אמת.
· שיפוע של -3.322 מציין שיעילות הגברה של PCR היא יעילה של 1, או 100%, וכמות תוצר ה-PCR מכפילה את עצמה בכל מחזור.
· שיפוע קטן מ-3.322 (למשל, -3.8) מצביע על יעילות PCR
· שיפוע גדול מ-3.322 (למשל, -3.0) מצביע על כך שיעילות ה-PCR נראית גדולה מ-100%, וזה מוזר, כיצד יכול מחזור אחד של PCR ליצור יותר מכפול מהתוצר המוגבר?מצב זה מתרחש בשלב הלא ליניארי של תגובת ה-PCR, כלומר, יש כמות גדולה של הגברה לא ספציפית.

עקומת התכה
לאחר השלמת הגברה של qPCR, מוצר ה-PCR מחומם.ככל שהטמפרטורה עולה, תוצר ההגברה הדו-גדילי נמס בהדרגה, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הקרינה.כאשר מגיעים לטמפרטורה מסוימת (Tm), מספר רב של מוצרים יימס.הקרינה יורדת בחדות.למוצרי PCR שונים יש ערכי Tm שונים וטמפרטורות התכה שונות, כך שניתן לזהות את הספציפיות של PCR.

עקומת התכה (עקומת נגזרת)
עקומת ההיתוך נגזרת כדי ליצור מפת שיא, שיכולה להציג בצורה אינטואיטיבית יותר את המצב של שברי מוצרי PCR.מאחר שטמפרטורת ההיתוך היא ערך ה-Tm של קטע ה-DNA, ניתן לשפוט כמה פרמטרים המשפיעים על ערך ה-Tm של קטע ה-DNA, כגון גודל המקטע, תכולת ה-GC וכו'. באופן כללי, על פי עקרונות תכנון הפריימר שלנו,אורך המוצר המוגבר הוא בטווח של 80-300bp, כך שטמפרטורת ההיתוך צריכה להיות בין 80°C ל-90°C.

פירוש עקומת ההיתוך: אם השיא העיקרי היחיד מופיע בין 80°C-90°C, זה אומר שה-PCR הכמותי הפלורסנטי מושלם;אם השיא העיקרי מופיע בין 80°C-90°C ושיאים שונים מופיעים מתחת ל-80°C, הדימר פריימר נחשב בעצם.אתה יכול לנסות להגדיל את טמפרטורת החישול כדי לפתור אותה;אם השיא העיקרי מופיע בין 80°C-90°C, והשיא השונות מופיע שוב כשהטמפרטורה עולה, זה בעצם נחשב שיש זיהום DNA, ויש להסיר DNA בשלב הראשוני של הניסוי.

כמובן, יש עדיין כמה מצבים חריגים, אשר יפורקו אחד אחד למטה.
3. ידע מתקדם

כדי לעשות qPCR, אני צריך לומר MIQE,מינימום מידעלפרסום שלכמותיPCR בזמן אמתניסויים - המידע המינימלי לפרסום מאמרים על PCR כמותי בזמן אמתניסויים .על מנת לפשט את ההבנה של כולם, נפשט את התוכן המרכזי.

אתה יכול לחפש את הטקסט המקורי של MIQE באינטרנט, והדבר החשוב ביותר הוא שהוא קובע אתרשימת תיוג נתונים שיש לספק בעת פרסום מאמר .

סוקרים יכולים לשפוט את איכות הניסוי על ידי קריאת פרטים אלה;קוראים עתידיים יכולים גם להשתמש בזה כדי לחזור על הניסוי או לשפר אותו.
ראוי לציין שברשימה זו, החשיבות של כל רשימה מסומנת ב-E או D בהתאמה.מה זה אומר?ה: מידע חיוני (יש להגיש);ד: מידע רצוי (ספק כמה שיותר).

MIQE (1) - עיצוב ניסיוני
חלאות רבים שסיימו את ההגנה לאחר סיום לימודי התואר השני לא יידעו לעצב ניסוי באופן עצמאי, לפתוח את המחברות ולעשות מה שהמורה אומר להם לעשות.כתוצאה מכך, העיצוב הניסיוני לא היה קפדני, ומחלקת העריכה של המגזין אמרה שהם רוצים להמציא את התמונה הזו והתמונה הזו, אז הם עשו זאת בטירוף.כך נוצרים הזבלים!

קרוב יותר לבית, העיקרון הראשון של הניסוי הוא לקבועקפדנות ההיגיון הניסיוני.הדבר הבסיסי ביותר הוא תכנון הניסוי, והדבר החשוב ביותר בתכנון הניסוי הוא כיצד להגדיר את מדגם היעד, מדגם ההתייחסות (בקרה) ומספר החזרות, כך שניתן יהיה להתייחס לנתוני הניסוי, להשוות ולשכנע.

מדגם היעדהכוונה לדגימה המחייבת אותנו לזהות את גן המטרה לאחר טיפול מסוים.מדגם ההתייחסותהוא המדגם ללא כל טיפול, אשר מכונה לעתים קרובות סוג פרא בביולוגיה.

שכפולים ניסיונייםחשובים מאוד.בדרך כלל, מספר השכפולים המשכנעים חייב להיות יותר משלושה.יש להבחין מהו שכפול ביולוגי ומהו שכפול טכני.

שכפולים ביולוגיים: אותו ניסוי אימות נעשה עם חומרים שונים (זמן, צמחים, קבוצות, לוחות תגובה).

שכפול ביולוגי
ניקח כדוגמה את הטיפול בהדברה בפלפל.אנחנו רוצים לרסס חומרי הדברה על שלושת הצמחים של ABC, ואז שלושת הצמחים של ABC הם שלושה שכפולים ביולוגיים, והם אותו ניסוי אימות שמתבצע עם חומרים שונים.אבל בתור ניסוי, בהחלט יש צורך בביקורת, ולכן נוכל לרסס את אחד מענפי צמח A ליצירת קבוצת ניסוי של צמח A, ולא לרסס את שאר הענפים של צמח A ליצירת קבוצת ביקורת.עשה את אותו הדבר עבור B ו-C.

שכפולים טכניים (כפולים טכניים): זהו ניסוי חוזר שנועד למנוע שגיאות הנגרמות על ידי פעולה, שהוא למעשה חור כפול הכלול באותו חומר.גם הטיפולים וגם הבקרות חייבות להיות משוכפלות (לפחות שלוש) של גן המטרה ושל גן ההתייחסות הפנימי.

חזרה טכנית
קח שוב את הפלפל שטופל בחומרי הדברה כדוגמה.עבור קבוצת הניסוי של צמח A, עשינו שלושה חורים של PCR של 1, 2 ו-3 עבור גן המטרה שלו וגן ההתייחסות הפנימי שלו בהתאמה, כדי לקחת את הממוצע לאחר הגילוי.לשליטה במפעל A מטופלות גם קבוצות באותו אופן.באופן דומה, בצע את אותו הטיפול עבור צמחי B ו-C.זוהי חזרה טכנית.

ראוי לציין זאתמה שנכנס לסטטיסטיקה היא החזרה הביולוגית, והחזרה הטכנית היא לבדוק אם יש תופעות אקראיות בתהליך הניסוי, כדי להפוך את תוצאות הניסוי לאמינות, כלומר למנוע טעויות על ידי לקיחת הממוצע שלהן כפי שאנו אומרים לעתים קרובות.

בקרות שליליות-NTC ו-NRT
NTC (שליטה ללא תבנית), בקרה ללא תבנית, משמשת כדי לוודא אם החומר הניסוי מזוהם.בדרך כלל, מים משמשים כתבנית.אם יש תגובה פלורסנטית, זה מצביע על כך שהתרחש זיהום חומצת גרעין במעבדה.

זיהומים אלו מגיעים מ: מים לא טהורים, ריאגנטים לא מוסמכים המכילים DNA אנדוגני, זיהום פריימר, זיהום ציוד מעבדה, זיהום אירוסול וכו', צורך להשתמש בסורקי RNase ומעכבי RNase.זיהום אירוסול הוא הקשה ביותר למצוא.דמיינו שהמעבדה שלכם היא כמו ערפיח, עם חומצות גרעין שונות תלויות באוויר.

NRT (No-Reverse Transcriptase), הבקרה ללא שעתוק הפוך, היא ה-RNA המשומלל הלא-הפוך כבקרה שלילית, שהיא הבקרה של שאריות gDNA.

כאשר עושים ביטוי גנים, כמות ה-RNA מזוהה על ידי זיהוי כמות ה-cDNA לאחר שעתוק הפוך.אם יש שאריות gDNA כאשר RNA מטוהר, זה יגרום לשגיאות בתוצאות הניסוי, מכיוון שהתוצאות בפועל שהתקבלו הן gDNA ו-cDNA.ברמה המצטברת, לא רק cDNA, יש להסיר לחלוטין את gDNA במהלך מיצוי RNA.

MIQE (2) - מידע לדוגמה
מה שנקרא מידע לדוגמה אומר שכאשר אנו מפרסמים מאמר על qPCR, עלינו להסביר את המידע לדוגמה בבירור, שהוא חלק הכרחי מהמאמר.באופן דומה, כאשר אנו מעבדים דגימות, עלינו גם להסדיר את הפעולות שלנו כדי להבטיח את תקפות הדגימות.

תיאור המדגם הוא רק תוצאה, ועלינו לשים לב יותר לחומרים שנלקחו במהלך כל הניסוי.

בחירת חומרי ניסוי
דגימות דם - בחר דם טרי, לא יותר מ-4 שעות.דגימות תאים - בחרו לאסוף תאים טריים בתקופה של צמיחה נמרצת.רקמת בעלי חיים - בחרו רקמות טריות שצומחות במרץ.רקמות צמחיות - בחרו רקמות טריות וצעירות.

בטח שמתם לב שיש מילת מפתח במשפטים הספורים האלה: טרי .
עבור הדגימות הנ"ל, הערכה הטובה, החסכונית והיציבה בשוק היא הערכה של Foregene, שיכולה לחלץ במהירות ובקלות את ה-DNA וה-RNA שלהם.

ערכת מיני DNA בדם

ערכת בידוד RNA כוללת של תאים

ערכת בידוד כולל RNA של בעלי חיים

ערכת בידוד כולל RNA של צמחים

Kit Total RNA Isolation Plant Plus

ערכת בידוד DNA של צמחים

אחסון חומרים ניסיוניים
באופן כללי, אנו לא ממליצים לאחסן דגימות, אם התנאים מאפשרים זאת.עם זאת, ישנם חברים רבים שאינם יכולים לבצע ניסויים מיד לאחר הדגימה, וחלקם אף צריכים לשאת מיכלי חנקן נוזלי לשדה לצורך דגימה.

עבור סוג כזה של חבר חרוץ, אני יכול רק לומר שאתה לא מבין חומרים מתכלים מגיב.כעת חברות מתכלות ריאגנטים רבות מייצרות ריאגנטים שיכולים לאחסן דגימות RNA בטמפרטורת החדר, ואתה יכול לבחור להשתמש בהם.שיטת האחסון הקונבנציונלית היא אחסון חנקן נוזלי, באמצעות מיכל חנקן נוזלי קטן וקל לנשיאה.לאחר הבאת הדגימה חזרה למעבדה, אחסן אותה במקרר -80 מעלות צלזיוס.

עבור ניסויים הכוללים RNA, יש לפעול לפי עקרון שש המילים:טמפרטורה נמוכה, ללא אנזימים,ומָהִיר .

קל להבין את הרעיון של טמפרטורה נמוכה;ללא אנזימים, RNase נמצא בכל מקום בעולם בו אנו חיים (אחרת היית נהרג מ-HIV), אז איך להימנע מ-RNase בעת ביצוע ניסויים הוא מושג חשוב מאוד;מָהִיר,אין קונג פו בעולם שאי אפשר לשבור, רק מהירות אי אפשר לשבור.

לכן, במובן מסוים, ככל שזמן החילוץ קצר יותר, כך הערכה טובה יותר.למהפורג'יןהערכה של מדגיש מהירות, כי הם יודעים את זה היטב.

נ.ב.: יש בנות שעושות ניסויים בזהירות רבה, אבל הן לא טובות כמו טלטלה אחרי כמה שנים של עבודה.הם מרגישים שאלוהים אינו הוגן, מתלונן על אחרים ומחפש חיים.למעשה, היא לא הבינה את זה.הוא לא הגן היטב על הרנ"א, ונגן הסלאם דאנק היה זריז.כשהוא עשה את הניסוי, הוא חשב שהוא יסיים את ה-slam dunk עם שלוש פעמים, חמש פעמים ושתי חלוקות, אבל הוא עשה את הניסוי היטב.

הערה: איטי יותר, יותר סיכויים לפלישת RNase.איך לאמן את עצמך להיות מהיר?אין מצב, פשוט תתאמן יותר.

עבור ניסויים שונים ודגימות שונות, עדיין יש צורך לקרוא ספרות נוספת ולבחור שיטה מתאימה לעיבוד.עבור תהליך איסוף ואחסון הדוגמאות, MIQE דורש שהיא חייבת להיות כתובה בבירור בעיתון, כדי שהסוקרים יוכלו לבדוק את מהימנות הנייר, וגם לצעירים ההמומים יהיה נוח לחזור על הניסוי שלכם.

למרות שניסויים ביולוגיים קשים, הם מתקדמים.אם לא תיזהר, אתה יכול להפיל את העולם.למשל, להפוך את ה-SARS למשבר ביוכימי, או לייצר אורז היברידי כדי להציל 1.3 מיליארד אנשים.התמונה למטה היא ניסוי כימי, אתה צריך להבין כמה אתה גאה במחקר שלך רק על ידי התבוננות במראה הזין שלו.תשכח מזה, אל תשחיר אותו.

MIQE (3) – מיצוי חומצת גרעין.
מיצוי חומצת גרעין הוא אירוע גדול, וכל הניסויים בביולוגיה מולקולרית מתחילים עם מיצוי חומצת גרעין.קודם כל, בואו נעתיק את התוכן של MIQE על מיצוי חומצת גרעין.

כשמסתכלים על הטופס הזה, אתה לא יכול להישאר על פני השטח.הצורה היא דוגמה.כדי להיות תלמיד מוביל, אתה חייב לשאול למה.התוכן המהותי של טבלה זו הוא: המשךהטוהר, השלמות, העקביות וכמות המיצוי של RNA .

החלק הראשון שלתהליך או מכשיר הוא שלב מיצוי חומצת הגרעין.אם אתה משתמש במחלץ חומצות גרעין אוטומטי לחילוץ (מתקדם, אנא צור איתי קשר לרכישה), עליך לציין את שם הדגם של המכשיר.

שם הערכה ו

יש להסביר בבירור איזו ערכה שימשה לפרטי השינוי, אילו ריאגנטים מיוחדים נוספו או אילו פעולות מיוחדות בוצעו כדי שאחרים יוכלו לחזור על הניסוי שלך בקלות.

יש אנשים שמוסיפים כמה ריאגנטים מיוחדים בעת חילוץ דגימות מיוחדות, מתוך מחשבה שזה הנשק הסודי שלהם ואל תספרו לאחרים.תוך שמירה על סודיות, הם גם מאבדים את ההזדמנות לגרום למאמר שלך לזרוח.אל תהיה חכם, אתה צריך להיות יותר ישר מג'אנג הזקן בארץ במחקר מדעי, אם אתה רוצה להיות חכם, המאמר יגרום לך להיות טיפש.

חייב לזכור את מספר המוצר של הערכהכאשר אתה מזמין את הערכה וכותב את המאמר.בדרך כלל ישנם שני מספרים בערכה: חתול - מספר קטלוגי (מספר מוצר, מספר מאמר), לוט - מספר חבילת מוצר (משמש לציון מאיזו אצווה המוצר הגיע).

בנוסף, מספר ה-CAS משמש לעתים קרובות בהזמנת ריאגנטים ביוכימיים, ואני אעשה אותו פופולרי יחד.מספר ה-CAS הוא המספר שניתן על ידי האגודה האמריקנית לכימיה לכל תרופה כימית חדשה.בדרך כלל, שלושה מספרים מחוברים באמצעות מקף.מספר CAS של Rushui: 7732-18-5.לכימיקלים יש לרוב כינויים מרובים, אך מספר ה-CAS הוא ייחודי.בעת הזמנת תרופה, תוכל לבדוק תחילה את מספר ה-CAS שלה.

קרוב יותר לבית, למה אנחנו צריכים לתאר את הדברים האלה בצורה ברורה?למעשה, זה גם כדי לבדוק את איכות מיצוי ה-RNA.השימוש במכשירים ובערכות יהפוך את מיצוי ה-RNA לעקבי יותר.סולם המיצוי של מעבדות רגילות אינו גדול, וניתן להשיגו עם ערכות.

הפרטים של טיפול ב-DNase או RNase
הנושא החשוב של PCR כמותי פלואורסצנטי הוא למנוע זיהום DNA, ואל לערוך ניסויים אם יש זיהום.לכן, חובה לציין את התהליך בו השתמשת לעיבוד ה-DNA, על מנת להוכיח שה-DNA בתהליך הניסוי הוסר לחלוטין ומלא.מיוצג על ידי תרשים סכמטי.

תרשים סכמטי של RNA ו-DNA
באופן כללי, השיטה להסרת DNA היא טיפול ב-RNA עם DNase לאחר מיצוי.עם זאת, מדובר בשיטות ישנות יחסית.ערכות מיצוי RNA מסחריות הצליחו להסיר DNA במהלך תהליך המיצוי מבלי להוסיף DNase.לדוגמה, סדרת ערכות מבית Foregene.

הערה: הסרת DNA במהלך מיצוי רנ"א היא חרב פיפיות מסוכנת מאוד, שתאריך את זמן הפעולה של מיצוי הרנ"א ותגביר את הסיכון לפירוק רנ"א.ביסודו של דבר, זה פשרה בין תפוקת RNA לטוהר.

בנוסף, כמות ה-DNase המתווספת לעמודת הספיחה המבוססת על סיליקה קטנה מאוד, ויש להשתמש ב-DNase איכותי כדי להשיג את האפקט.DNase לא מותאם לא ניתן לעיכול במהירות ובשלמות.זהו מבחן לרמתו הטכנית של הסוחר.כמובן, ישנם סוחרים מוזרים עוד יותר שמתגאים בכך שניתן להסיר DNA ללא DNase.אפשר לומר שכל מי שמתרברב שאפשר להסיר לגמרי את ה-DNA ללא DNase הוא חוליגן.DNA הוא מבנה דו-גדילי יציב יחסית, ואי אפשר למחוק אותו רק על ידי דיבור וצחוק.

הערכת זיהום
שיטת הערכה: זיהוי אלקטרופורזה, 1% אגרוז, 6V/cm, 15 דקות, טעינה 1-3 ul

ניתוח כמותי של חומצת גרעין
נמדד בדרך כלל באמצעות ספקטרופוטומטר UV.הרשו לי תחילה לפרסם את המשמעות של שלושת הערכים של OD260, OD280 ו-OD230.
·OD260nm: זהו אורך הגל של שיא הספיגה הגבוה ביותר של חומצת גרעין, והערך הנמדד הטוב ביותר נע בין 0.1 ל-1.0.אם לא, דלל או רכז את הדגימה כדי להביא אותה לטווח.
·OD280nm: זהו אורך הגל של שיא הספיגה הגבוה ביותר של חלבון וחומרים פנולים.
·OD230nm: זהו אורך גל הספיגה של שיא הספיגה הגבוה ביותר של פחמימות.

לאחר מכן, בואו נדבר על התפקיד של כל אינדיקטור.עבור A260, ניתן להשתמש בו כדי למדוד את התשואה של חומצת גרעין.כאשר OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

לטוהר, עלינו להסתכל על היחסים שאנו רואים בדרך כלל: OD260/280 ו-OD260/230.
· DNA טהור: OD260/280 שווה בערך ל-1.8.כאשר הוא גדול מ-1.9, זה מצביע על זיהום RNA, וכאשר הוא קטן מ-1.6, זה מצביע על זיהום חלבון ופנול.
· RNA טהור: 1.7
·OD260/230: בין אם זה DNA או RNA, ערך הייחוס הוא 2.5.כאשר הוא נמוך מ-2.0, זה מעיד על זיהום של סוכר, מלח וחומרים אורגניים.

שלמות RNA

חשוב מאוד למדוד את שלמות ה-RNA.באופן כללי, יש צורך לבצע ניסוי ג'ל דנטורציה של RNA כדי לבדוק אם הבהירות בין 28S ו-18S RNA היא קשר כפול.כאשר הרצועה השלישית 5S מופיעה, זה אומר שה-RNA החל להתפרק, למעט חסרי חוליות.

נתונים להערכת איכות RNA: בנוסף לבדיקות הנ"ל, ישנן גם כמה בדיקות מכשירים מתקדמות יותר מבחינת שלמות ה-RNA, כמו בדיקת תקינות ה-RQI של מערכת האלקטרופורזה האוטומטית Experion, שיכולה לזהות אם ה-RNA מתכלה באופן בלתי נראה.

במחקר מדעי, PCR כמותי פלואורסצנטי הוא השוואה בין גן המטרה לגן הייחוס הפנימי.לכן, בתהליך של שימור דגימת RNA, מיצוי RNA וכו', המטרה העיקרית היא להבטיח את שלמות ה-RNA.

כיצד שלמות ה-RNA משפיעה על האיזון בין גן המטרה לגן הייחוס הפנימי ניתן להבין בקלות מהאיור שלהלן.השפלה תוביל לחוסר שלמות הגן, בין אם זה חוסר השלמות של גן ההתייחסות הפנימי או חוסר השלמות של גן המטרה, תהיה לכך השפעה רבה על הנתונים.

דיאגרמה סכמטית של גן המטרה וגן הייחוס, לא חייבת להיות נכונה

בדיקת עיכוב (האם ערך ה-CT מדוכא בריכוז גבוה או נמוך או בתנאים אחרים)

אם לוקחים את הנתון הזה כדוגמה, ערכי Ct של חמש העקומות הם כדלקמן.התפלגות ערכי ה-CT בין העקומות אינה אחידה, וערכי ה-Ct מתעכבים בריכוז גבוה ונמוך, המקרה של עיכוב PCR.

נקודת מפתח: בתהליך מיצוי RNA, עלינו לזנוח תפיסות מוטעות ולבסס תפיסות נכונות.

הרעיון השגוי הוא: מיצוי RNA רק רודף את התשואה, מתוך מחשבה שככל שכמות ה-RNA המתקבלת גדולה יותר, כך ייטב.למעשה, כשאנחנו עושים כימות, אם מספר הגנים אינו גדול במיוחד, אנחנו לא צריכים הרבה RNA.כמות ה-RNA שאתה מחלץ היא די והותר.

הקונספט הנכון הוא:מיצוי RNA צריך לרדוף אחר טוהר, שלמות ועקביות.טוהר יכול להבטיח שהתעתוק ההפוך שלאחר מכן לא יעוכב והנתונים לא יושפעו מ-DNA.שלמות מבטיחה את האיזון בין רצפי מטרה והפניות פנימיות.עקביות מבטיחה טעינת מדגם יציבה.

MIQE (4) - תמלול הפוך
תפיסה מוטעית: המרדף אחר נפח דגימה גבוה יותר.
קונספט נכון: חפש עקביות (יציבות), ללא קשר לכמות ה-RNA שנטען, היעילות של שעתוק הפוך נשארת עקבית, מה שמבטיח שהבדלים ב-cDNA יכולים לשקף באמת הבדלים ב-mRNA.
אנו מסבירים תהליך זה באמצעות דיאגרמה סכמטית:

דיאגרמה סכמטית של יעילות תעתיק הפוך, לא תהיה נכונה
קודם כל, עלינו להבין את ההבדל בין תהליך שעתוק הפוך לתהליך PCR.PCR עובר תהליכי חימום וחישול מרובים, ושבר המטרה גדל באופן אקספוננציאלי;בעוד שלשעתוק הפוך אין תהליך זה, אנו יכולים לדמיין שתעתוק הפוך הוא למעשה אחד לאחד במהלך תהליך השכפול, כמה שיותר חלקים של RNA

כפי שיש יכולים לקבל כמה שיותר חלקים של מידע cDNA, זה צריך להיות מובן עד עכשיו, כי פרגמנטים גדולים וקטנים עברו תעתיק לאחור, ואי אפשר להתמקד בפרגמנט אחד.ומכיוון שכמות ה-RNA קטנה יחסית, גם כמות ה-cDNA המתקבלת קטנה יחסית, בניגוד ל-PCR שיש לו אפקט הגברה, כך שבעצם אי אפשר לזהות.

תוצאות אלקטרופורזה של cDNA
שנית, באופן אידיאלי, שעתוק הפוך מבוצע אחד לאחד, אבל שום תמלול הפוך מאף חברה לא יכול להשיג את האפקט הזה.בעיקרון, היעילות של רוב התעתיקים הפוכים נעה בין 30-50%.אם זה המקרה, היינו מעדיפים לקבל יעילות שעתוק הפוך יציבה יחסית, וזה מה שאנחנו רוצים לראות באיור: 3 RNAs מקבלים 2 cDNAs, 6 RNAs מקבלים 4 cDNAs, כך שלא משנה כמה דגימה נטענת, יעילות השעתוק ההפוכה היא יציבה יחסית.אנחנו לא רוצים לראות את המצב שבו יעילות התעתיק לאחור אינה יציבה וריכוז גבוה מעוכב.

אז איך לוודא אם יעילות התעתיק ההפוך יציבה?השיטה מאוד פשוטה, אתה רק צריך לעשות בדיקת השוואה: האחת היא תמלול לאחור ל-cDNA לאחר דילול הכפל של RNA, והשני הוא לבצע דילול כפול לאחר שעתוק לאחור ל-cDNA, ואז לעשות qPCR כדי לראות את השיפוע המתקבל האם זה עקבי.כתלמיד מוביל, אתה צריך להבין את זה בשניות.כפי שמוצג מטה:

דילול של RNA ו-cDNA כדי לבדוק אם היעילות של שעתוק הפוך יציבה
תמלול הפוך וערכה
כיצד יכול PCR כמותי פלואורסצנטי מושלם להיות בעל תמלול הפוך וערכה מצוינים.תמלול הפוך מחולק באופן גס לשני סוגים לפי המקור, AMV אוM-MLV, והביצועים שלהם זהים לאלו המוצגים בטבלה.

פעילות RNase H
RNase H הוא Ribonuclease H, השם הסיני הוא ribonuclease H, שהוא אנדוריבונוקלאז שיכול לבצע הידרוליזה ספציפית של RNA בשרשרת ההיברידית DNA-RNA.RNase H אינו יכול לבצע הידרוליזה של קשרי הפוספודיסטר ב-DNA או RNA חד-גדילי או דו-גדילי, כלומר, אינו יכול לעכל DNA או RNA חד-גדילי או דו-גדילי.משמש בדרך כלל בסינתזה של הגדיל השני של cDNA.

זה דבר מוזר.אנו אומרים שלטרנסקריפטאזה הפוכה יש פעילות של RNase H, לא שלטרנסקריפטאז הפוך מכיל RNase H, וייתכן שלא ניתן יהיה להפריד בין RNase H מתעתיק הפוך, אולי בגלל הקונפורמציה של קבוצות מסוימות ב-Reverse transcriptase פעילות זו נגרמת על ידי ה-Reverse transcriptase.

לכן, ללא קשר ליעילות השעתוק ההפוכה הגבוהה יותר של AMV, פעילות RNase H שלו מפחיתה את התפוקה של cDNA.כמובן, יצרני ריאגנטים מייעלים כל הזמן את המוצרים שלהם כדי לחסל את פעילות RNase H בתעתיק הפוך ככל האפשר כדי להגדיל את התשואה של cDNA.
טמפרטורת חישול

מבנה משני של RNA בטמפרטורות שונות
ראה את האיור לעיל עבור המבנה המשני של RNA בטמפרטורות שונות, והשתמש בכלי המקוון mFold כדי לקבוע את המבנה המשני של שבר היעד בתנאי טמפרטורה וריכוז מלח ספציפיים.ב-55°C, המבנה המשני של ה-RNA עדיין מורכב מאוד, טרנסקריפטאז הפוך לא יכול לעבוד, ולא ניתן לפתור את המבנה המשני לחלוטין עד ל-65°C, בעוד שהטמפרטורה האופטימלית של AMV ו-M-MLV נמוכה בהרבה מטמפרטורה זו.
מה לעשות?המבנה המשני הוא הזיווג המשלים של התבנית עצמה, מה שמוביל לתחרות חזקה בין ה-primer וה-reverse transcriptase לבין התבנית, וכתוצאה מכך לסדרה של בעיות כמו E נמוך וחזרתיות לקויה.

מה לעשות?רק הגדל את טמפרטורת החישול ככל האפשר.

יצרני ריאגנטים רבים משפרים את התעתיק ההפוך שלהם באמצעות הנדסה גנטית.חלקם מגבירים את טמפרטורת התגובה, כמו Jifan ו-Aidelai, וחלקם מסירים את הקבוצה הפעילה של האנזים RNase H כדי לשפר את הזיקה בין האנזים לתבנית ה-RNA.זיקה גבוהה יכולה באופן תחרותי לסחוט את המבנה המשני ולקרוא אותו בצורה חלקה, וגם לשפר מאוד את היעילות של תעתיק לאחור.
נקודת מפתח: שעתוק הפוך חשוב יותר כדי לרדוף אחרי העקביות של יעילות שעתוק הפוך (האנזימים חייבים להיות לא רק יעילים אלא גם יציבים), ולא כמות הדגימה הנטענת, אם לא מדובר ב-PCR כמותי פלואורסצנטי בקנה מידה גדול במיוחד, זה לא יהיה אפשרי כלל.cDNA מרובים.
יצרנים שונים עשו גם כמה מאמצים במרדף אחר עקביות.לדוגמה, רוב החברות ארוזות כעת תמלול הפוך כערכה סטנדרטית למכירה, וזו בחירה טובה.
לדוגמה, ערכות RT Easy Series של Foregene:

RT Easy I (ראש מיקס לערכת סינתזת cDNA של גדיל ראשון)

MIQE (5) - מידע על גן מטרה

האיור לעיל מסביר
1. האם גן זה יעיל לניסויים חוזרים ניתן בדרך כלל לאמת על ידי ניסויים חוזרים.
2. מזהה גנים, אתה יודע.
3. אורך גן, האורך הכולל של גן המטרה בהחלט אין בעיה.בעת תכנון פריימרים, ודא שאורך האמפליקון הוא בין 80-200bp כדי להבטיח יעילות הגברה טובה יותר.
4. מידע השוואת רצף Blast, יש להשוות את גן המטרה ב-genebank כדי למנוע הגברה לא ספציפית.
5. נוכחות פסאודוגנים.פסאודוגן הוא רצף DNA הדומה לגן נורמלי אך מאבד את תפקודו התקין.הוא קיים לעתים קרובות במשפחת הרב-גנים של האוקריוטים.בדרך כלל הוא מיוצג על ידי ψ.זהו עותק DNA גנומי שאינו מתפקד בגנום הדומה מאוד לרצף הגנים המקודד., בדרך כלל אינם מתומללים, ואין להם משמעות פיזיולוגית ברורה.
6. מיקום פריימרים ביחס לאקסונים ואינטרונים.בשנים הראשונות, כאשר פתרנו את בעיית זיהום ה-DNA, שמנו לב לעתים קרובות למיקומי הפריימרים, האקסונים והאינטרונים, ובדרך כלל שקלנו לתכנן פריימרים על פני אינטרונים כדי להימנע מהגברת DNA.אנא ראה את האיור שלהלן: שחור מייצג אינטרונים, כחולים שונים מייצגים אקסונים, ורוד מייצג פריימרים נפוצים, ואדום עז מייצג פריימרים בעלי אינטררון.

סכמטי, אף פעם לא נכון
איזו תוכנית מושלמת זו נראית, אבל למעשה, ברוב המקרים, הפריימרים של הטרנס-אינטררון אינם קסומים כפי שמדמיינים, והם גם יגרמו להגברה לא ספציפית.אז הדרך הטובה ביותר למנוע זיהום DNA היא להסיר DNA לחלוטין.
7. תחזית קונפורמציה.השתמש שוב בדוגמה זו, השתמש בכלי המקוון mFold כדי לקבוע את המבנה המשני של קטע המטרה בטמפרטורה וריכוז מלח ספציפיים.

מבנה משני של RNA בטמפרטורות שונות
המבנה המשני הוא הזיווג המשלים של התבנית עצמה, מה שיוביל לתחרות חזקה בין הזיווג של הפריימר לתבנית, והסיכוי לקשירת הפריימר קטן יותר, מה שגורם לסדרה של בעיות כמו E נמוך וחזרתיות לקויה.באמצעות חיזוי תוכנה, אם אין בעיית מבנה משנית, זה יהיה נהדר.אם כן, מאמר ההמשך שלנו ידון באופן ספציפי כיצד לפתור בעיה זו.

MIQE (6)-qPCR אוליגונוקלאוטידים

עבור PCR כמותי פלואורסצנטי, הדבר הראשון שאתה נאבק איתו בכל יום הוא מיצוי RNA, והדבר השני עשוי להיות עיצוב פריימר.
קודם כל, אנחנו עדיין בודקים את הכללים לגבי עיצוב פריימר לפי רשימת ה-MIQE.זה כל כך פשוט שהחלאים יכולים לצחוק, ואנחנו יכולים לסיים את זה במשפט אחד: גלה את הרצף והמיקום של בדיקת הפריימר ואת שיטת השינוי.עבור שיטת טיהור פריימר, סינתזת פריימר כל כך זולה כיום, qPCR ראוי לשיטות טיהור PAGE ומעלה, והמידע של מכשיר הסינתזה אינו חשוב.אנשים רבים עושים פריימרים כבר עשרות שנים ואינם יודעים שהסינתיסייזר הוא ABI3900.
לגבי העקרונות של תכנון פריימר, אינך צריך לשנן אותם בשפה הפתוח, מכיוון שרוב תוכנות עיצוב פריימר או הכלים המקוונים יכולים לטפל בבעיות אלו (הכלי המקוון המומלץ primer3.ut.ee/), ו-99.999% מעיצוב הפריימר לא נעשה באופן ידני.
פשוט בדוק את הנקודות הבאות לאחר עיצוב הפריימרים:
1. תכנון פריימרים קרוב לקצה 3': במקרה של שימוש בפריימרים של oligo dT עבור סינתזת גדיל ראשון של cDNA, בהתחשב ביעילות השעתוק ההפוך ושלמות ה-RNA, יש לעצב את הפריימרים המעוצבים קרוב לקצה ה-3 כדי לשפר את יעילות ההגברה.השתמש בתמונה כדי להסביר באופן הבא (אין דרך להבין זאת):

למה צריך לעצב פריימרים קרוב לקצה 3', זה לא חייב להיות נכון
2. ערך TM: ערך Tm הוא 55-65 מעלות צלזיוס (מכיוון שפעילות האקסונוקלאז היא הגבוהה ביותר ב-60 מעלות צלזיוס), ותכולת ה-GC היא 40%-60%.
3. BLAST: על מנת למנוע הגברה לא ספציפית של הגנום, יש להשתמש ב-Blast לאימות משלים.

MIQE(7)—תהליך qPCR

1. ערכת qPCR
על פי הדרישות של MIQE, עלינו לתאר בבירור את תנאי התגובה המלאים במאמר, כולל תצורת מערכת התגובה PCR, באיזו ערכה משתמשים, מי היצרן, מהי גודל מערכת התגובה, האם נעשה שימוש בשיטת הצבע או בשיטת הבדיקה, הגדרות תוכנית PCR.נהגים ותיקים בהחלט יגלו שכל עוד הערכה נבחרת, המידע הנ"ל נקבע בעצם.
כיום, ייצור וייצור של ערכות PCR כמותיות פלואורסצנטיות היא טכנולוגיה בוגרת מאוד.כל עוד אתה לא בוחר ביצרנים גרועים במיוחד, ההסתברות לבעיות לא גבוהה, אבל אנחנו עדיין רוצים לשתף אותך בכמה נקודות:
אנזים Taq להתחלה חמה:החלק החשוב ביותר ב-PCR הוא אנזים Hot-Start Taq.אנזימי ההתחלה החמה בשוק מחולקים בדרך כלל לשני סוגים, האחד הוא אנזים התחלה חמה שעבר שינוי כימי (אפשר לדמיין אותו כהטמעת פרפין), והשני הוא אנזים התחלה חמה לשינוי נוגדנים (קשירת אנטיגן-נוגדנים).שינוי כימי הוא דרך מוקדמת להפעלה חמה של אנזימים.כאשר מגיעים לטמפרטורה מסוימת האנזים ישחרר את פעילותו.האנזים חם התחלה שעבר שינוי נוגדנים משתמש בשיטות ביולוגיות כדי לחסום את פעילות האנזים.כאשר תגיע לטמפרטורה מסוימת, הנוגדן יפונה ויושבת כחלבון, ופעילות האנזים תופעל.

עם זאת, מה התועלת בזה?זה המצב, פעילות השחרור של אנזימים שעברו שינוי נוגדנים מהירה יותר מזו של אנזימים שעברו שינוי כימי, כך שמבחינת רגישות, לאנזימים שעברו שינוי נוגדנים יש יתרון קל, כך שבעצם אין אנזימים שעברו שינוי כימי בערכות בשוק.אם יש, אז הטכנולוגיה של היצרן הזה עדיין תקועה בעידן המילניום.
ריכוז יוני מגנזיום:ריכוז יוני מגנזיום חשוב מאוד בתגובת PCR.ריכוז יוני מגנזיום מתאים יכול לקדם את שחרור פעילות האנזים Taq.אם הריכוז נמוך מדי, פעילות האנזים תפחת משמעותית;אם הריכוז גבוה מדי, ההגברה הלא ספציפית המזוזת באנזים תוגבר.ריכוז יוני המגנזיום ישפיע גם על חישול הפריימרים, טמפרטורת ההיתוך של התבנית ומוצרי PCR, ובכך ישפיע על התפוקה של מקטעים מוגברים.ריכוז יוני המגנזיום נשלט בדרך כלל על 25mM.כמובן, עבור ערכה טובה, יש לשלוט היטב על ריכוז יוני המגנזיום.חלק מהסוחרים מוסיפים למגיב חומר קלתי של יוני מגנזיום, שיכול להשיג את ההשפעה של התאמה אוטומטית של ריכוז יוני המגנזיום.
ריכוז צבע פלואורסצנטי:צבע פלואורסצנטי, שהוא הירוק SYBR שאנו משתמשים בו בדרך כלל, מייצר קרינה בעיקר על ידי קשירה לחריץ הקטן של דנ"א דו-גדילי, מכיוון שהקשירה של הצבע לדנ"א דו-גדילי אינה ספציפית, כלומר כל עוד משולבים בו DNA דו-גדילי, יכולה להתרחש פלואורסצנטיות, ולכן תבניות אות-דנ"א ישלבו במערכת תבניות אותות-דנ"א.
נ.ב.: בשל תכונותיו הרגישות לאור, המוצרים בשוק נארזים בדרך כלל בשפופרות צנטריפוגות אטומות חומות (כמתואר בתמונה למטה).עם זאת, זה יתקל בבעיה.קשה לראות אם הנוזל נשאב בעת הדגימה.מהבחינה הזו, Qingke היא אכן הידידותית ביותר למשתמש (כפי שמוצג בתמונה למטה), והצינור השקוף ארוז בשקית פח אטומה.לאחר מכן הכניסו אותו לשקית פח, תוך התחשבות בנוחות של הימנעות מאור ודגימה.עליך לבחור את מספר המוצר הנכון.TSE204 הוא קיום סופר חסכוני, שגורם לי לרצות לשתול דשא.

גם ריכוז הצבע הפלורסנטי חשוב מאוד.אם הריכוז נמוך מדי, עקומת ההגברה לא תעלה בשלב מאוחר יותר ואינה מושלמת;אם הריכוז גבוה מדי, זה יגרום להפרעות רעש.מכיוון שה-PCR הכמותי הפלורסנטי תלוי בעיקר בערך ה-CT, אם ריכוז הצבע הפלורסנטי אינו מותאם כראוי, הנקודה הנמוכה עדיפה מהנקודה הגבוהה.כמובן, ריכוז הצבע המתאים הוא הטוב ביותר.

ROX: צבעי ROX משמשים לתיקון שגיאות אות הקרינה בין טוב לבאר.יצרני מכשירים מסוימים דורשים כיול, בעוד שאחרים לא.לדוגמה, השימוש במכשיר הגברה PCR בזמן אמת של Thermo Fisher Scientific מצריך בדרך כלל כיול, כולל 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus וכו'. הוראות הערכה הכלליות יתארו זאת.
qPCR Mix של Foregene מכיל גם צבע ROX שנוח לשימוש בדגמים שונים.

ערכת PCR בזמן אמת-תקמן

טיפול בקשר מימן חלש: הטיפול בקשרי מימן חלשים הוא עניין טכני יחסית.שום דבר לא קרא את המדריכים של ערכות רבות, אבל אף אחד מהם לא הזכיר את הנושא הזה.למעשה, זה כל כך חשוב.שילוב הבסיסים תלוי בעיקר בחוזקם של קשרי מימן.קשרי מימן חזקים הם הגברה רגילה, וקשרי מימן חלשים מובילים להגברה לא ספציפית.אם לא ניתן לבטל היטב קשרי מימן חלשים, לא ניתן להימנע מהגברה לא ספציפית.במסגרת המחבר, רק חברות בודדות שמו לב לבעיה זו.כאשר אתם קונים את הערכה, תוכלו להתייחס האם שקלתם פתרון בהקשר הזה לערכה שאתם רוצים לבחור.

נפח תגובה: מערכת 20-50ul נמצאת בשימוש נפוץ יותר, ונפחים קטנים יותר עשויים לגרום לשגיאות.באופן כללי, הוראות הערכה ימליצו על שימוש בנפחי תגובה של PCR.אל תהיה חכם והשתמש בהיקפים קטנים יותר כדי לחסוך בעלויות.המטרה של.הנפח שהומלץ על ידי הסוחרים אכן נבדק, ויכול להיות שהם לא יכולים לפתור את בעיית השגיאות הנגרמות מנפחים קטנים.
2. היצרן ומספר המאמר של לוחית הצינור
כולם מכירים את העיקרון של PCR כמותי פלואורסצנטי.איסוף הקרינה מתבצע בעיקר באמצעות פקקי צינורות PCR.בבחירת חומרים מתכלים PCR, שימו לב לשתי נקודות: העברת אור טובה ומתאימה למכשיר.באופן כללי, הלוחות והצינורות של מותגים מיינסטרים בסדר, אבל אתה צריך לבחור בקפידה מבחינת התאמה, אחרת לא תוכל להשתמש במכשיר.

4. ידע ברמה גבוהה

MIQE (8)—אימות qPCR
זהו העדיפות העליונה של qPCR!כל כך הרבה גיבורים נפלו כאן לחול.כמובן, ייתכן גם שהתמזל מזלכם והגנים שחקרתם הם פשוטים, אז ריחפתם במערת הקרח לאורך הרוח.מידע האימות של qPCR נועד לבדוק את מהימנות הנתונים.אנו מפרטים את פרטי האימות הדרושים כדלקמן:

1. מבחן מפרט
הספציפיות של הגברה של גן מטרה נבדקת על ידי בדיקה אם תמונת האלקטרופורזה היא פס בודד;אימות רצף;עקומת התכה כדי לראות אם מפת השיא היא יחידה;אימות עיכול אנזים ושיטות אחרות.
כאן, אנו מתמקדים ב-tהוא ניתוח של הגברה לא ספציפית באמצעות שיטת ההתכה של עקומות.באופן כללי, כאשר אנו מתכננים פריימרים, הגודל של קטע המוצר נדרש להיות בטווח של 80-200bp, מה שהופך את טמפרטורת ההיתוך של מוצר PCR לטווח של 80-85 מעלות צלזיוס.לכן, אם יש פסגות שונות, חייבים להיות מוצרי הגברה לא ספציפיים אחרים;אם השיא מופיע מתחת ל-80 מעלות צלזיוס, זה נחשב בדרך כלל לדימר פריימר;אם השיא מופיע מעל 85°C, זה נחשב בדרך כלל לזיהום DNA או הגברה לא ספציפית יותר של שברים גדולים.
הערה: לפעמים יש רק שיא בודד ב-80 מעלות צלזיוס.בשלב זה, יש לדבוק בתפיסה זו.סביר להניח שתוצאות ההגברה הן כולן דימרי פריימר.

עקומת התכה נורמלית (שיא בודד ללא הגברה לא ספציפית)

עקומת התכה בעייתית (הגברה לא ספציפית של פסגות מזויפות)
【ניתוח מקרה】

יש שיא עיקרי, אבל דימר הפריימר רציני
עקומת ההיתוך הבודדת באיור למטה יכולה בקלות להטעות את עיניך, לחשוב שזה ניסוי מושלם, אבל התוצאה שגויה לחלוטין.בשלב זה, עלינו להסתכל על טמפרטורת ההיתוך.טמפרטורת השיא היא מתחת ל-80 מעלות צלזיוס, שהיא לחלוטין פריימר-דימר.

אין שבר מטרה, כל הדימרים של הפריימר
הנה, אח שלי לא יכול להפסיק.התמונה למטה היא תמונה שצולמה בטלפון נייד שנשלח אליי על ידי זבל.הריאגנטים שבהם השתמש הם כולם מותגים נפוצים בתעשייה.הוא עבר ממותג T-prefix אחד למותג T-prefix אחר.אני חושב שכבר ניחשתם את זה.הזבל בכה אליי: "הריאגנט המשמש בתמונה הראשונה טוב מדי, והשיא הוא יחיד.מאוחר יותר, לאחר השימוש במגיב שהמלצת, הוא הופך להיות כמו התמונה השנייה, עם פסגות מעורבות.עשית אותי אומלל."
הפרידו את שני הגרפים.במבט ראשון, לאחד יש פסגה בודדת, ולשני יש פסגה כפולה.שטויות, שיא בודד זה כמובן בסדר.האם זה נכון?
יותר גרוע מדו אי, אם אשים את שתי התמונות בתמונה למטה, תבינו מיד.למעשה, אנו משתקים בקלות על ידי סוג כזה של תמונה.לאחר ניתוח מדוקדק, מצאנו כי: השיא של הדמות הראשונה הוא ב-75 מעלות צלזיוס, שהוא דימר פריימר לחלוטין;השיא של הדמות השנייה מופיע ב-75°C ו-82°C, לפחות יש המוצר מופיע.

תמונות של משוב מתלמידים
אז הבעיה הבסיסית היא לא הבעיה של ריאגנטים, אלא הבעיה של עיצוב פריימר.יחד עם זאת, זה גם מוכיח שכמה מותגים גדולים אינם באיכות ברזל, וזה גם מוכיח את מה שאחי אמר קודם: זה לא מותג הריאגנטים שתומך במאמר שלך.המאמר שלך הוא שהקפיץ את מותג הריאגנטים.רק תארו לעצמכם, אם הזבל לא ישנה את הריאגנטים, הנתונים הלא נכונים יישלחו לכתב העת, ומה שיקרה יהיה טרגדיה.
2. ערך Ct של פקד ריק
אל תסביר, אם לבקרה הריקה יש ערך Ct, זה לא זיהום?עם זאת, אתה עדיין צריך להבין לאיזה פקד ריק יש ערך Ct.אם זה NTC, זה אומר שיש DNA זר כמו זיהום מגיב.אם זה NRT, זה אומר של-RNA המופק יש זיהום DNA.
3. עקומה סטנדרטית
כולל השיפוע ונוסחת החישוב, ניתן לחשב את יעילות ה-PCR באמצעות הנוסחה.ניסוי מושלם מחייב את השיפוע של העקומה הסטנדרטית להתקרב ל-3.32, ו-R² להתקרב ל-0.9999.
4. טווח דינמי לינארי
הטווח הדינמי של התגובה הוא ליניארי.על פי התבנית המשמשת ליצירת העקומה הסטנדרטית, הטווח הדינמי צריך לכלול לפחות 5 שיפועים בריכוז, ולשים לב לשינוי ערכי Ct בשיפועי ריכוז גבוהים ושיפועים בריכוז נמוך.
5. דיוק זיהוי
שינויים בתוצאות qPCR, כלומר יכולת חזרה לקויה, כלומר דיוק לקוי, נגרמים מגורמים רבים, כולל טמפרטורה, ריכוז ותפעול.דיוק qPCR בדרך כלל הופך פחות לשליטה ככל שמספר ההעתקים יורד.באופן אידיאלי וריאציה בתוך ניסוי, וריאציה טכנית זו צריכה להיות שונה משונות ביולוגית, ושכפולים ביולוגיים יכולים להתייחס ישירות להבדלים סטטיסטיים בתוצאות qPCR בין קבוצות או טיפולים.בפרט עבור מבחני אבחון, יש לדווח על הדיוק הבין-מבחנים הטוב ביותר (החזרה) בין אתרים ומפעילים.
6. יעילות זיהוי ו-LOD (ב-Multiplex qPCR)
LOD הוא הריכוז הנמוך ביותר של 95% מהדגימות החיוביות שזוהו.במילים אחרות, ריכוז ה-LOD הכלול בקבוצה של שכפולים של גן מטרה לא יעלה על 5% מהתגובות הכושלות.בעת ביצוע אנליזת qPCR מרובה, במיוחד לזיהוי סימולטני של מוטציות נקודתיות או פולימורפיזמים, qPCR multiplex צריך לספק ראיות לכך שהדיוק של שברי מטרה מרובים אינו נפגע באותה צינור, זיהוי מרובה וזיהוי צינור בודד היעילות וה-LOD צריכים להיות זהים.במיוחד כאשר גנים מטרה בריכוז גבוה וגנים מטרה בריכוז נמוך מוגברים בו זמנית, יש לשים לב לבעיה זו.
בעיות ופתרונותבאופן כללי, הבעיות בהן נתקלים לעתים קרובות באיתור באגים ב-qPCR מתמקדות בהיבטים הבאים:
· הגברה לא ספציפית
·בחירה קשה של ריכוז פריימר ובעייתיות בפריימר-דימרים
· טמפרטורת החישול אינה מדויקת
·מבנה משני משפיע על יעילות ההגברה
הגברה לא ספציפית
הגברה לא ספציפיתמתרחשת, בדרך כלל נשקול אם עיצוב הפריימר אינו מתאים, אך אם אינך ממהר להחליף את הפריימרים, תוכל לנסות תחילה את השיטות הבאות (העיקרון מצורף גם):
· הגדל את טמפרטורת החישול - נסה ליצור קשרי מימן חלשים שאינם מסוגלים לשמור;
·קיצור זמן חישול והתארכות - להפחית את הסיכוי לקשרי מימן חלשים;
·הפחתת ריכוז הפריימר - הפחתת הסיכוי לקישור של פריימרים מיותרים ואזורים שאינם מטרה;
יעילות הגברה נמוכה
המצב ההפוך להגברה לא ספציפית - יעילות הגברה נמוכה, והאמצעים להתמודדות עם יעילות הגברה נמוכה הם בדיוק הפוך:
· הארכת זמן החישול וההתארכות;
· שנה ל-PCR תלת-שלבי והפחתת טמפרטורת החישול;
· הגדל את ריכוז הפריימר;
Ps: סטודנטים לתארים מתקדמים רבים שנולדו בשנות ה-90 אינם מוכנים ללמוד כיצד לנפות באגים בניסויים, ומקווים שהערכה תוכל לפתור את הבעיה לחלוטין (אם אתה רוצה ללכת לחברת ריאגנטים לעשות מחקר ופיתוח לאחר סיום הלימודים), למעשה, גם יצרני הריאגנטים חושבים כך, אני מקווה שזה טיפש זה יכול לשמש כשתשיג את זה, אז של יצרני ריאגנטים לא-ספציפיים השקענו הרבה בבעיה, כולל מאמצים ספציפיים. גורמי ספיגה.כדי לפתור את הבעיה בקלות, טיפשים עדיין צריכים לקרוא את המבוא של חברת הריאגנטים כדי לראות אם יש גורם שסופג קשרי מימן חלשים.
בחירה קשה של ריכוז פריימר ובעיות עם פריימר-דימרים
שיטה 1: באופן כללי, להוראות הערכה עבור qPCR יש מערכות מומלצות וריכוזי פריימר מומלצים.
שיטה 2: איתור באגים על ידי קביעת שיפוע ריכוז הפריימר.התמונה למטה נגנבה מחברה להמחשה.האיור שלהלן מציג את התוצאות הכמותיות של הקרינה שנעשו עם שלושה שיפועים בריכוז פריימר (100nM, 250nM, 500nM) וארבעה שיפועים של ריכוז תבנית (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).ערך ה-Ct של תוצאות הניסוי משורטט באופן הבא:

בחירת ריכוז פריימר שרשרת כל ריכוז פריימר לקו באופן הבא:

הבחירה בריכוז הפריימר ברורה, הקשר הליניארי של ריכוז הפריימר של 100nM ו-250nM טוב יותר, והקשר הליניארי של ריכוז הפריימר של 500nM גרוע יחסית.ב-100nM ו-250nM, ערך Ct של 250nM קטן יחסית, כך שריכוז הפריימר האופטימלי הוא 250nM.בדרך כלל ניתן לראות פריימר-דימרים חמורים בעקומת ההיתוך.מה אם הפריימרים המעוצבים לא יכולים להימנע מפריימר-דימרים?
שיטה 3: הפחיתו את כמות הפריימרים והעלו את טמפרטורת החישול (אין צורך להסביר).
הערך האמפירי של טמפרטורת החישול הוא 60 מעלות צלזיוס.אם אינך בטוח, כיצד לבחור טמפרטורת חישול מתאימה יותר?התשובה זהה לבחירת ריכוז הפריימר -מבחן שיפוע.צלם תמונה מחברת Bio-rad כדי להמחיש את הבעיה.להגברה של קטע מטרה מסוים, הגדר שמונה שיפועים טמפרטורה, כל אחד עם שלוש חזרות, ועקומת ההגברה המתקבלת היא כדלקמן:

בחירת טמפרטורת חישול:
·70°C, 69°C—בעיקרון, לא ניתן לשלב את הפריימרים, ולכן אין הגברה.
·67.3°C - יש כמות קטנה של הגברה בהתחלה, וערך Ct גדול יחסית.
·64.5°C——ערך Ct יורד.
·ב-60.7 מעלות צלזיוס, 58.0 מעלות צלזיוס, 56.2 מעלות צלזיוס ו-55.0 מעלות צלזיוס, ערכי ה-Ct בעצם נטו להיות יציבים, אך ערכי הקרינה הסופיים היו שונים.
איך לבחור?עקרון: העיקרון הראשון הוא ערך ה-Ct הגבוה יותר.עבור אותו ערך Ct, בחר טמפרטורת חישול גבוהה יותר כדי למנוע דימריזציה והגברה לא ספציפית.למרות שיש ערך פלואורסצנטי גבוה יותר ב-55 מעלות צלזיוס, ייתכן שיש בו דימרים או הגברה לא ספציפית.
אבל אם אתה חכם כמוך, אתה בהחלט תחשוב: מבחינה לוגית, אם תגובת ה-PCR היא מאוד ספציפית, כל עוד ריכוז הפריימר עולה על הדרישה המינימלית, לנקודות הגבוהות והנמוכות לא אמורה להיות השפעה, בדיוק כמו צבעי פלורסנט ו-dNTP.ואכן, כל עוד טמפרטורת החישול מותאמת כראוי, השפעת ריכוז הפריימר על ערך ה-Ct תצטמצם באופן טבעי.

טמפרטורת החישול עוברת אופטימיזציה כראוי, והשפעת ריכוז הפריימר על CT תצטמצם למינימום
מבנה משני משפיע על יעילות ההגברה
בואו ניקח את התמונה מ-Bio-rad כדי להמחיש את הבעיה.זה גם מעצב שיפוע טמפרטורה כדי להגביר גן עם מבנה משני.

נוצר מבנה משני
ניתן לראות שככל ששיפוע הטמפרטורה יורד, מוצרים מתחילים להופיע וערך ה-Ct נע קדימה, מגיע לערך המינימלי ב-60.7 מעלות צלזיוס, ואז ככל ששיפוע הטמפרטורה יורד, ערך ה-Ct הופך גדול יותר.לעומת זאת, ככל שהטמפרטורה עולה, המבנה המשני נפתח ויעילות ההגברה עולה.לאחר הגעה לטמפרטורה מסוימת, הגדלת הטמפרטורה לא יכולה לשפר את יעילות ההגברה.מכיוון שלא ניתן לשלב את הפריימרים ביציבות בשלב זה.לָכֵן,חפש את הטמפרטורה עם ערך Ct הנמוך ביותר, שהיא הטמפרטורה הטובה ביותר להגברת תבנית המבנה המשני!כמובן, שוטים חכמים חייבים לדעת שאם זה לא הכרחי, עדיף להחליף את הפריימרים ולהימנע מאזור המבנה המשני.
5. רמת יישום
MIQE - ניתוח נתונים

ניתוח הנתונים ניתן בעיקר על ידי מכשיר ה-PCR הכמותי הפלורסנטי.במאמר הקודם נעשתה עבודת ניתוח נתונים רבה, כמו בקרת החסר, שהוסברה בתכנון הניסוי.הובהרו גני ההתייחסות הפנימיים, המספרים החוזרים וכו'., כאן אנו מסבירים בעיקר את היישום של qPCR.
qPCR נמצא בשימוש נרחב, ואימות ניסיוני ואבחון חומצות גרעין הם התרחישים הנפוצים ביותר.
כימות מוחלט
ללוג (ריכוז ראשוני) יש קשר ליניארי עם מספר המחזורים.ניתן לשרטט עקומה סטנדרטית מתקן עם מספר העתק התחלתי ידוע, כלומר ניתן לקבל את הקשר הליניארי של תגובת ההגברה.לפי ערך Ct של הדגימה, ניתן לחשב את הריכוז בדגימה.כמות התבניות שיש לכלול.

שיטת חישוב כמותית מוחלטת
כימות מוחלט חייב להתבסס על העקומה הסטנדרטית.כדי ליצור עקומה סטנדרטית, נדרש תקן.בדרך כלל, התקן הוא פלסמיד המתקבל על ידי שיבוט גן המטרה.למה זה פלסמיד?מכיוון שה-DNA של פלסמיד מעגלי הוא היציב ביותר.יש לדלל את המוצר הסטנדרטי ב-5 עד 6 שיפועים לפי יחס ההכפלה (דילול פי 10), ולשים לב לאחידות בעת הדילול.תן לערך Ct ליפול בין 15-30.

הכנה סטנדרטית
במקביל, יש לדלל בהתאם גם את הדגימה לבדיקה (זכור את מקדם הדילול), וגם ערך ה-Ct אמור לרדת בין 15-30.המוצר הסטנדרטי + המדגם לבדיקה מונחים יחד על המכונה.לאחר הריצה, בוצעה עקומה סטנדרטית עם החומר הסטנדרטי, והדגימות שייבדקו הוכנסו לעקומה הסטנדרטית לחישוב הריכוז.
כימות HBV של וירוס הפטיטיס B הוא כימות אבסולוטי טיפוסי, שיכול לחשב את מספר העתק הנגיף ב-1 מ"ל של דם.
חישוב מספר העתק
ריכוז הדגימה לבדיקה (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × מקדם דילול
משקל מולקולרי לדוגמה = מספר בסיסים × 324
מספר העותק של הדגימה לבדיקה (עותקים/אול) = ריכוז הדגימה לבדיקה / המשקל המולקולרי של הדגימה × 6 × 1014

שיטת חישוב של מספר עותק

האמור לעיל הוא שיטת החישוב לקביעת הכמות.זוהי בעיה מתמטית שניתן לפתור לאחר סיום חטיבת הביניים, ובעיות מתמטיות נפתרות בדרך כלל באמצעות מחשבים.אם אתה לא מבין, אתה יכול לבוא לתקשר.
כימות יחסי
כימות יחסי משמש בעיקר במחקר מדעי.כמה וירוסים יש ב-1 מ"ל של דם, וזה נגיף DNA, זה אירוע דטרמיניסטי יחסית: ניתן לקבוע את כמות הדם, ונגיף ה-DNA יציב יחסית.עם זאת, קשה לנו להשוות את מספר עותקי השעתוק של גן מסוים בעלה, מכיוון שקשה לקבוע את הגודל, המשקל והרגישות של העלה, קשה לקבוע את כמות ה-RNA המופק, וגם קשה לקבוע את היעילות של שעתוק הפוך, כלומר, כל שלב עלול לגרום לנתונים הניסויים לכלול באגים ולא ניתן להשתמש בהם.
לכן, כימות יחסי חייב להציג אלמנט:גן ההתייחסות הפנימי.
במילים אחרות, כימות יחסי הוא למעשה השוואה בין גן המטרה לגן הייחוס הפנימי.בהשוואה לאותה רקמה ובאותו תא, ההשפעה של גודל המדגם, כמות מיצוי ה-RNA, יעילות השעתוק הפוכה ויעילות ה-PCR קטנה יחסית.בגלל גודל המדגם הקטן, הן גני ההתייחסות הפנימיים והן גני המטרה הופחתו יחסית.זו הסיבה שהדגשנו את האחידות והיציבות בעבר.
גנים התייחסות פנימיים הם בדרך כללגנים לניהול משק הבית(גנים שומרי בית), המתייחסים לסוג של גנים המתבטאים ביציבות בכל התאים, ותוצרים שלהם נחוצים כדי לשמור על פעילויות החיים הבסיסיות של התאים.
אל תבלבלו את המושג הזה.גנים לניהול משק הבית הם מונחי תפקוד ביולוגי, בעוד שגני התייחסות פנימיים הם מונחים טכניים ניסיוניים.גנים לשמירה על הבית צריכים לעבור אימות לפני שניתן יהיה לבחור אותם כגנים להתייחסות פנימית.
לדוגמה, בחרנו מספר גנים של משק בית באיור למטה כדי לבדוק את רמות הביטוי שלהם בתאי רקמה שונים, ומצאנו שרמות הביטוי של β-2-microglobulin היו שונות למדי מאלו של שלושת הגנים האחרים, כך שלא ניתן היה להשתמש בהם כגנים התייחסות פנימיים.

לאחר הבנת פונקציית התיקון של גן ההתייחסות הפנימי, נגזרים שני אלגוריתמים עקב הכנסת גן ההתייחסות הפנימית.
· שיטת עקומה סטנדרטית כפולה
·2 – שיטת △△Ct (שיטת השוואת ערכי CT)
אם אתם מעוניינים לחקור מינים ותפקודי גנים, אנא וותרו על המחקר על אלגוריתמים והשתמשו בנוסחאות ישירות, או השתמשו ישירות במכונות;אם אתה סטרייט במתמטיקה והנדסה, אנא אל תהסס.
שיטת עקומה סטנדרטית כפולה
כימת את גן המטרה וגן משק הבית של דגימת הבקרה והדגימה שתיבדק דרך העקומה הסטנדרטית, ולאחר מכן חשב את הערך היחסי לפי נוסחת החישוב, שהיא רמת הביטוי היחסית.
יתרונות: ניתוח פשוט, אופטימיזציה ניסיונית פשוטה יחסית
חסרון: עבור כל גן, כל סבב ניסויים חייב ליצור עקומה סטנדרטית
יישום: אחת משתי השיטות הכמותיות היחסיות הנפוצות והמוכרות ביותר בחקר ויסות ביטוי גנים
הנוסחה היא כדלקמן:

הדוגמאות הן כדלקמן:

חשב את הכמות היחסית על סמך התוצאה הכמותית
2 – שיטת △△Ct (שיטת השוואת ערכי CT)

יתרונות: אין צורך לעשות עקומה סטנדרטית
חסרונות: ההנחה היא שיעילות ההגברה קרובה ל-100%;סטיית התקן היא < 5%, ומניחים שעקומת התקן והיעילות בין כל הגברה יהיו עקביות;האופטימיזציה של תנאי הניסוי היא מסובכת יותר.
יישום: אחת משתי השיטות הכמותיות היחסיות הנפוצות והמוכרות ביותר בחקר ויסות ביטוי גנים

כמובן שיעילות ההגברה היא בדרך כלל בלתי אפשרית להיות מושלמת 1. שיטת תיקון: אם אנו יודעים שלגן המטרה ולגן הייחוס יש אותה יעילות הגברה, אבל יעילות ההגברה אינה שווה ל-1, אז ניתן לתקן את 2－△△Ct כך: (1+E )－△△Ct, למשל, אם ניתן לתקן את יעילות ההגברה ל-1. .95－△△Ct
עד כה, התוכן על PCR כמותי פלואורסצנטי הגיע לסיומו.