היינו יצרן מנוסה.זוכה לרוב באישורים המכריעים של השוק שלה להנחה גדולה בסין רגישות גבוהה בדיקה חד-שלבית Rt-Qpcrערכה V2, איכות היא חיי המפעל, התמקדות בדרישת הלקוח היא המקור להישרדות ופיתוח החברה, אנו מקפידים על יחס עבודה ביושר ובתום לב, מצפים לבואך!
היינו יצרן מנוסה.זוכה לרוב באישורים המכריעים של השוק שלה עבורChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, החברה שלנו מבטיחה: מחירים סבירים, זמן ייצור קצר ושירות לאחר מכירה משביע רצון, אנו גם מברכים אותך לבקר במפעל שלנו בכל עת שתרצה.הלוואי עכשיו שיהיה לנו עסק נעים וארוך ביחד!!!

תיאורים

ערכה זו משתמשת במערכת חיץ תמוגה ייחודית שיכולה לשחרר במהירות RNA מדגימות תאים מתורבתות לתגובות RT-qPCR, ובכך לחסל את תהליך טיהור ה-RNA שגוזל זמן רב ומייגע.ניתן להשיג את תבנית ה-RNA תוך 7 דקות בלבד.ריאגנטים 5×Direct RT Mix ו-2×Direct qPCR Mix-SYBR המסופקים על ידי הערכה יכולים להשיג במהירות וביעילות תוצאות PCR כמותיות בזמן אמת.

5×Direct RT Mix ו-2×Direct qPCR Mix-SYBR הם בעלי סבילות מעכבת חזקה, והליזאט של הדגימות יכול לשמש כתבנית עבור RT-qPCR ישירות.ערכה זו מכילה את ה-RNA הייחודי בעל זיקה גבוהה Foregene transcriptase הפוכה, ו-Hot D-Taq DNA פולימראז, dNTPs, MgCl₂, חוצץ תגובה, מייעל PCR ומייצב.

מפרטים

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

רכיבי ערכה

תכונות ויתרונות

■ פשוט ויעיל: עם טכנולוגיית Cell Direct RT, ניתן לקבל דגימות RNA תוך 7 דקות בלבד.

■ הדרישה לדגימה קטנה, ניתן לבדוק עד 10 תאים.

■ תפוקה גבוהה: הוא יכול לזהות במהירות RNA בתאים שתרביתו בצלחות של 384, 96, 24, 12, 6-בארים.

■ DNA Eraser יכול להסיר במהירות גנומים משוחררים, להפחית מאוד את ההשפעה על תוצאות הניסוי הבאות.

■ מערכת RT ו-qPCR אופטימלית הופכת את התעתוק האחורי דו-שלבי RT-PCR ליעיל יותר ול-PCR ספציפי יותר, ועמיד יותר בפני מעכבי תגובה RT-qPCR.

יישום ערכה

היקף היישום: תאים בתרבית.

- RNA משוחרר על ידי תמוגה מדגימה: ישים רק לתבנית RT-qPCR של ערכה זו.

- הערכה יכולה לשמש למטרות הבאות: ניתוח ביטוי גנים, אימות אפקט השתקת גנים בתיווך siRNA, בדיקת תרופות וכו'.

תרשים

אחסון וחיי מדף

יש לאחסן את חלק I של ערכה זו בטמפרטורה של 4℃;יש לאחסן את החלק השני ב-20℃.

יש לאחסן את Foregene Protease Plus II ב-4℃, אין להקפיא ב-20℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR צריך להיות מאוחסן ב-20℃ בחושך;אם נעשה בו שימוש תכוף, ניתן לאחסן אותו גם ב-4 ℃ לאחסון לטווח קצר (השתמשו בו תוך 10 ימים). היינו יצרן מנוסה.זוכה לרוב באישורים המכריעים בשוק שלה להנחה גדולה בסין רגישות גבוהה בדיקה חד-שלבית Rt-Qpcr Kit V2, איכות היא חיי המפעל, התמקדות בדרישת הלקוח היא המקור להישרדות ופיתוח החברה, אנו מקפידים על כנות וגישה עבודה בתום לב, מצפים לבואך!
הנחה גדולהChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, החברה שלנו מבטיחה: מחירים סבירים, זמן ייצור קצר ושירות לאחר מכירה משביע רצון, אנו גם מברכים אותך לבקר במפעל שלנו בכל עת שתרצה.הלוואי עכשיו שיהיה לנו עסק נעים וארוך ביחד!!!

QuickEאסיTM Cell Direct RT-qPCR Kit -תקמan

Cat.No.DRT-01021/01022

עבור RT-qPCR ישיר לתא באמצעות ≤ 1000,000 תאים

הצגת המוצר

מוצר זה משתמש במערכת חיץ תמוגה ייחודית לשחרור מהיר של RNA מדגימות תאים מתורבתות עבור תגובות RT-qPCR, תוך ביטול תהליך טיהור RNA שגוזל זמן רב ומייגע, ורק 7 דקות להשגת תבנית ה-RNA הנדרשת, עם 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman המסופקת על ידי הערכה יכולה להשיג תוצאות PCR בזמן אמת במהירות וביעילות.

5× Direct RT Mix ו-2× Direct qPCR Mix-Taqman הם בעלי סבילות מעכבת חזקה ויכולים לבצע היפוך יעיל והגברה ספציפית באמצעות ה-lysate של הדגימה שיש למדוד כתבנית.המגיב מכיל Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer ומייצב, אשר ניתן להשתמש בו עם חיץ תמוגה כדי לזהות דגימות במהירות ובקלות, ובעל מאפיינים של רגישות, ספציפיות ויציבות גבוהה.

תכונות מוצר

טכנולוגיית Cell Direct RT פשוטה ויעילה שלוקחת 7 דקות בלבד כדי לקבל דגימות RNA.

דרישות המדגם הן קטנות, וניתן להשתמש במינימום 10 תאים בתרבית לצורך ניסויים.

תפוקה גבוהה לרכישה מהירה של RNA של תאים מתורבתים כגון צלחות 384, 96, 24, 12 ו-6 בארים.

DNA Eraser מסוגל להסיר במהירות גנומים משוחררים, ולהפחית מאוד את ההשפעה על תוצאות הניסוי הבאות.

מערכות RT ו-qPCR אופטימליות מאפשרות RT-PCR דו-שלבי עם שעתוק לאחור יעיל יותר, ספציפיות וסובלנות חזקה יותר של מעכבי תגובה RT-qPCR.

יישום ערכה

היקף היישום: תאים מתורבתים.

תמוגה מדגימה פירשה RNA: משמש רק כתבנית RT-qPCR דו-שלבית.

ניתן להשתמש בערכות למטרות הבאות: ניתוח ביטוי רגולטורי של גנים, בדיקת אללים, בדיקת תרופות וכו'.

מגבלות ערכה

מקטעים מוגברים ≤ 300 bp.

ערכות משמשות להתרבות תאים טריים.

בקרת איכות המוצר

על פי מערכת ניהול האיכות הכוללת של FOREGENE, כל אצווה של ערכות מסדרת Cell Direct RT-qPCR נבדקת בקפדנות מספר פעמים כדי להבטיח את האמינות והיציבות של האיכות של כל אצווה של ערכות.

תכולת ערכה

*:תזיזת תאים, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ניתן לרכוש בנפרד, פרטים מסופקים בנספח 1 (עמוד 13).

תנאי אחסון

1. תנאי משלוח

כל התהליך של הובלת קופסת קרח בטמפרטורה נמוכה, כדי להבטיח שהערכה נמצאת במצב <4°C.

2. תנאי אחסון

אחסן את חלק I ב-4°C וחלק II ב-20°C.

יש לאחסן את Foregene Protease Plus II ב-4°C, לא להקפיא ב-20°C.

ריאגנט 2× Direct qPCR Mix-Taqman מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס, או ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש קצר טווח אם נעשה בו שימוש תכוף (תוך 10 ימים).

מידע על רכיבי ערכה

מאגר CL: מספק את הסביבה הנדרשת לתגובות תמוגה של תאים.

Buffer ST: מפסיק את החומר הפעיל בליזאט כדי למנוע השפעות על RT שלאחר מכן.

מחק DNA: מסיר DNA, השפעת הסרת הגנום בניסויים הבאים.

5× Direct RT Mix: מכיל זיקה גבוהה ל-RNA Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, מייצבים, משפרים, מייעלים ופריימרים לשעתוק הפוך ליישור אופטימלי (Random Primer, Oligo(dT)₁₈תֶחֶל).

Foregene Protease Plus II: בהקשר של חיץ תמוגה, תאים עוברים ליזה כדי לשחרר חומצות גרעין.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: מגיב זה מכיל Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, חוצץ תגובה, מייעל PCR ומייצב.

20× ROX Reference Dye: משמש בדרך כלל על מכשירי הגברה בזמן אמת של PCR של ABI, Stratagene וחברות אחרות, הוא משמש כדי להתאים את ההבדל בין צינורות PCR וצינורות שנגרמו משגיאות מינון PCR.ריכוז 20× ROX Reference Dye הנדרש עבור מכשירים שונים הוא שונה, והמשתמש יכול להוסיף אותו בהתאם לריכוז המומלץ של המכשיר.

ddH ללא RNase₂O: מים מעוקרים אולטרה טהורים ללא RNase לתגובות RT-qPCR דו-שלביות.

אמצעי זהירות:(הקפד לקרוא בעיון את אמצעי הזהירות לפני השימוש בערכה)

שימו לב לשיטת הפעולה של הניסוי כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות.

שימו לב לניקיון של סביבת הניסוי והכלים כדי למנוע זיהום RNase ופירוק RNA.

קח דגימות תאים טריות או שמורות היטב ולעולם אל תשתמש בדגימות תאים שהופשרו בהקפאה.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman צריך להימנע מהקפאה-הפשרה חוזרת ונשנית, אחרת זה ישפיע על תעתיק הפוך ויעילות PCR.

הכנהמנותלפנימבצע

הקפד לקרוא את ההוראות בעיון לפני השימוש בערכה זו.ערכת Cell Direct RT-qPCR פשוטה, נוחה ומהירה לתפעול, וההוראות מספקות מידע מלא על הערכה כולה וכיצד להשתמש בה נכון.נא להכין את החומרים והציוד הניסיוני הדרושים לפני השימוש.

חומרים וציוד ניסיוני

◆ תאי תרבות.

◆ 1.5 מ"ל או 2 מ"ל, שפופרת צנטריפוגה ללא RNase/DNase, קצה ללא RNase/DNase, צינור qPCR סטרילי בנפח 0.2 מ"ל.

◆ מכונת qPCR, פיפטה, צנטריפוגה שולחנית (≥13,400×ז) (בהתאם לצרכי ניסוי) וכו'.

בְּטִיחוּת

◆ מוצר זה מיועד למטרות מחקר מדעי בלבד, נא לא להשתמש בו למטרות פרמצבטיות, קליניות, מזון וקוסמטיות.

◆ בעת שימוש בכימיקלים, לבשו בגדי מעבדה מתאימים, כפפות, משקפי מגן וכו'.

מבצעמדריכים

ניתן לרכוש בנפרד מערכות תזונת תאים, מערכות RT וחבילות תוספי פתרון תגובה qPCR, לפרטים בנספח 1 (עמוד 13).

מדריך הפעלה

ת: שחרור RNA לדוגמה

1. תאים טופלו מראש: שטפו את צלחת תרבית התאים עם PBS קר, ולאחר מכן ליט את התאים (10-10⁶), 10⁶ מאשר כמות התאים, מומלץ לבנות את התא ל-RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) או Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) למיצוי וטיהור RNA.

1.1.תאים נצמדים (צלחת 24 בארים כדוגמה)

1.1.1.קבע את מספר התאים בכל באר, קבע שמספר התאים הוא 1 × 10⁵, והשתמש בפיפטה כדי להסיר את מצע התרבות מכלי התרבות.

1.1.2.הוסף 200 μl של 1 × PBS מקורר מראש לכל באר.אין לבצע פיפטציה שוב ושוב ולהסיר PBS מהבארות.הטה את הצלחת והסר כמה שיותר PBS.המשך לשלב 2.

1.1.3.צלחת תרבית תאים שונה או טבלה מספר התייחסות 1-1 בצלחת תרבית תאים נוספה מקורר מראש 1 × PBS לשטיפת תאים.

טבלה 1-1: מינון PBS למספרים שונים של תאים

הערה:כדי להבטיח תאים נצמדים מוצקים,נמנע מספר רב של אובדן תאים בעת הכביסה.

1.2.תאים תלויים או תאים דביקים בתרבית בצלחות לא נקבוביות

1.2.1.תאים דביקים התורבתים בצלחות שאינן מרובות בארות (תאי השעיה מתחילים בשלב הבא 1.2.2), אוספים ומפרידים את התאים לפי שיטת איסוף התאים הרגילה ומניחים אותם בצלחת תרבית או בצינור צנטריפוגה;אם נעשה שימוש בטריפסיניזציה, יש צורך בצנטריפוגה לאיסוף התאים ולהסרת שאריות טריפסין, הוסיפו תאים מורחקים מ-PBS לתאים בודדים כדי לפזר את התאים.

1.2.2.לאחר ספירת מספר התאים, מנות תאים 1×10⁵ אחד לצנטריפוגה צינורות, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 10 דקות.

1.2.3.הוסף 200 μl PBS לצינור הצנטריפוגה, אין לבצע פיפטציה שוב ושוב, ולשאוב ישירות את ה-PBS.המשך לשלב 2. (אם קשה לזרז והתאים הושעו מחדש, ניתן לבצע בצנטריפוגה של 1000×g 10 דקות לאחר השלכת הסופרנטנט, גלולת התא המשך לשלב 2)

2. תמוגה תא: הסר את Buffer CL, הטמפרטורה שלו מאוזנת לטמפרטורת החדר, DNA Eraser ו-Foregene Protease Plus II, לפי מערכת תמוגה מוכנה בטבלה 1-2 הבאה: (תמיסת ליזה מוכנה לשימוש).

טבלה 1-2: מחשוף הכנת המערכת (הערה: בהכנה על הקרח)

3. (צלחת 24-באר כדוגמה) מטפטפים 200 μl של תערובת מאסטר תמוגגת תאים לתוך כל באר, נשוף שוב ושוב 5-10 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר (20-25 ℃) למשך 5 דקות.

הערה:כדי למנוע היווצרות של בועות, בבקשה כאשר קנה המידה לפיפטה מותאם ל-200μl או פחות.התאים עשויים להיראות עכורים לאחר תמוגה, וזה נורמלי.

4.(צלחת 24-באר כדוגמה) מתווספת בנוזל 20 μl Buffer ST (מערכות תמוגה שונות נוספו Buffer ST בכמות המוצגת בטבלה 1-3), חזרו על פיפטציה 5-10 פעמים, בטמפרטורת החדר (20-25 ℃) הודגרו למשך 2 דקות.

הערה:קצה הפיפטה הונח מתחת לפני השטח, מבטיח שהליסאט נוסף,כדי למנוע היווצרות של בועות, בבקשה כאשר קנה המידה לפיפטה מותאם ל-200μl או פחות.

טבלה 1-3:הוסף Buffer ST

5. ה-lysate משמש לניסויי RT-qPCR הבאים.אם לא ניתן לבצע את הניסויים הבאים בזמן, נא לשמור אותו על קרח למשך לא יותר משעתיים, ולאחסן ב-20℃ או -80 ℃ (לא יותר משלושה חודשים).

ב: הכנת מערכת RT

1. הוצא 5 × Direct RT Mix והנח אותו על אמבט קרח, תן לו להמיס באופן טבעי וערבב אותו בעדינות לשימוש מאוחר יותר;הוצא את RNase-Free ddH2O והמיס אותו והנח אותו על אמבט קרח לשימוש מאוחר יותר.הכן את מערכת התגובה על קרח לפי טבלה 2-1 להלן.

טבלה 2-1: הכנת מערכת תגובה RT

2. לאחר השלמת גיבוש המערכת, ערבבו בעדינות וצנטריפוגה בקצרה בטבלה הבאה 2 -2 תנאי תגובה RT תגובה.

טבלה 2-2: הגדרת מצב RT Reaction

3. לאחר השלמת התגובה, תוצר התגובה הונח ישירות על קרח עבור qPCR, נא לשים את השימור לטווח ארוך -20 ℃ או -80 ℃.

הערה: עקב השימוש בתבנית לא מטוהרת, משקעים לבנים עשויים להופיע במוצר השעתוק ההפוך.זו תופעה נורמלית.צנטריפו את הסופרנטנט מיד לניסויים הבאים.

תמיסת ריאקציית ה-RT המתקבלת מתווספת למערכות התגובה הבאות של Step Real Time PCR, מומלץ להוסיף כמויות הנעות בין 10-30% ממערכת התגובה.

C: הכנת מערכת תגובה qPCR

1. כמות מתאימה של B שהוכנה בשלב תבנית cDNA לפי הטבלה הבאה 3-1 להכנת מערכת תגובה.

הערה: כמות תבנית ה-cDNA מהווה 10-30% ממערכת ה-qPCR.לדוגמה, במערכת qPCR 20μl, הוסף 2-6 μl של חיץ תמוגה, אך לא יותר מ-6 μl.

2. האופטימיזציה תנאי qPCR טובים (טמפרטורת חישול, וכו') לתגובת qPCR (תנאי התגובה המפורטים בטבלה 3-2).

הערה: נסה להשתמש בתנאים מותאמים לתגובות qPCR כדי לקבל תוצאות טובות יותר.

טבלה 3-1: הכנת מערכת תגובת PCR

1*: ריכוז פריימר יכול להיות מותאם בטווח של 50-900 ננומטר כאשר ביצועי תגובת הפריימר גרועים.

הערה: ניתן להתאים את מערכת qPCR בהתאם לצרכים הניסויים ולמודל מחזור הקרינה.עבור qPCR ב-50μמערכת l, התאם את מינון המגיב באופן פרופורציונלי בהתאם ל-20μמערכת l.

2*: בחר את הריכוז הסופי המתאים של ROX Reference Dye בהתאם למחזור התרמי הכמותי של הקרינה.ריכוזי צבעי הייחוס ROX המתאימים ביותר עבור מחזורי כמות הקרינה הנפוצים מוצגים בטבלה שלהלן:

טבלה 3-2: מסופקים תנאי תגובת qPCR

הערה: על מנת להשיג את אפקט ה-qPCR הטוב ביותר, ניתן להשתמש ב-PCR גרדיאנט כדי לייעל את תנאי התגובה עבור תבניות שונות ופריימרים שונים.תנאי התגובה של PCR משתנים בהתאם לנתח הקרינה, התבנית, הפריימר וכו'. בפעולה הספציפית, יש לתכנן את תנאי התגובה האופטימליים בהתאם לתנאים הספציפיים של המחזור התרמי הכמותי, סוג התבנית, גודל השבר המעניין, רצף הבסיס של הפרגמנט המוגבר ותכולת ה-GC ואורך הפריימרים, כולל זמן ריאקציה וכו'.

עקרונות עיצוב פריימר בזמן אמת PCR

פריימר קדימה ופרימר לאחור

עבור PCR בזמן אמת, עיצוב פריימר חשוב מאוד.פריימרים קשורים לספציפיות וליעילות של הגברה של PCR, וניתן לעצב אותם תוך התייחסות לעקרונות הבאים:

◆ אורך פריימר: 18-30bp.

◆ תכולת GC: 40-60%.

◆ ערך Tm: תוכנת עיצוב פריימר, כגון פריימר 5, יכולה לתת את ערך ה-Tm של הפריימר.ערכי ה-Tm של הפריימרים במעלה הזרם והמורד הזרם צריכים להיות קרובים ככל האפשר.ניתן להשתמש גם בנוסחת חישוב Tm: Tm = 4°C (G + C) + 2°C (A + T).בעת ביצוע PCR, טמפרטורה מתחת לערך ה-primer Tm של 5 מעלות צלזיוס נבחרת בדרך כלל כטמפרטורת החישול (העלייה המקבילה בטמפרטורת החישול יכולה להגביר את הספציפיות של תגובת ה-PCR).

◆ פריימרים ומוצרי PCR:

◆ אורך המוצר להגברת PCR של פריימר עיצוב הוא רצוי 100-150bp.

◆ יש להימנע ככל האפשר מפריי תכנון באזור המבני המשני של התבנית.

◆ הימנע מהיווצרות של 2 או יותר בסיסים משלימים בין קצוות 3′ של פריימרים במעלה הזרם ומורד הזרם.

◆ בסיס מסוף פריימר 3′ לא יכול להיות קיים עם 3 G או C עוקבים נוספים.

◆ לפריימרים עצמם לא יכולים להיות מבנים משלימים, אחרת יווצר מבנה סיכת ראש המשפיע על הגברה של PCR.

◆ יש לפזר ATCG בצורה שווה ככל האפשר ברצף ה-primer, ולהימנע מהבסיס המסוף של 3′ כ-T.

נִספָּח1:Cell ישירRT-qPCR רכיב ערכהחבילת תוספת לא

1. פתרון תמיסת תאים