ידוע היטב כי בדוגמה המרכזית, RNA הוא המתווך התעתיק בין DNA וביטוי חלבון.בהשוואה לזיהוי של DNA, זיהוי של RNA יכול לשקף בצורה אובייקטיבית יותר את ביטוי הגנים באורגניזמים.ניסויים הכוללים RNA כוללים: qRT-PCR, RNA-Seq וזיהוי גני היתוך וכו'. בהתבסס על המאפיינים של ה-RNA עצמו (לטבעת הסוכר של RNA יש יותר קבוצת הידרוקסיל חופשית אחת לטבעת הסוכר של DNA), יחד עם מספר רב של RNases בסביבה, RNA הוא יותר לא יציב וקל יותר לפירוק מ-DNA.זבל פנימה, זבל החוצה, אם איכות ה-RNA לא טובה, אז תוצאות הניסוי חייבות להיות לא משביעות רצון, להתבטא באופן ספציפי בנתונים לא מדויקים או בחזרה לקויה.לכן, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר לעיבוד של RNA, והקישור של בקרת איכות חשוב יותר גם כדי להבטיח את הדיוק והדיוק של נתוני הניסוי הבאים.

לבקרת האיכות של RNA, יש בדרך כלל את השיטות הנפוצות הבאות:

• ספקטרופוטומטריה
• אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
• Agilent Bioanalyzer
• PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת
• שיטת צבע פלואורסצנטי של קוביט

01 ספקטרופוטומטריה

ל-RNA יש קשרים כפולים מצומדים ויש לו שיא ספיגה באורך גל של 260nm.על פי חוק למברט-ביר, אנו יכולים לחשב את ריכוז ה-RNA משיא הספיגה ב-260nm.בנוסף, אנו יכולים גם לחשב את טוהר ה-RNA לפי היחס של פסגות ספיגה של 260nm, 280nm ו-230nm.280 ננומטר ו-230 ננומטר הם שיאי הספיגה של חלבונים ומולקולות קטנות, בהתאמה.היחס של A260/A280 ו-A260/A230 של טוהר RNA מוסמך צריך להיות גדול מ-2. אם הוא קטן מ-2, זה אומר שיש זיהום חלבון או מולקולה קטנה בדגימת ה-RNA ויש צורך לטהר אותו שוב.מקורות זיהום ישפיעו על ניסויים במורד הזרם, כגון עיכוב יעילות ההגברה של תגובות PCR, וכתוצאה מכך תוצאות כמותיות לא מדויקות.לטוהר ה-RNA יש השפעה רבה על התוצאות הבאות, ולכן ספקטרופוטומטריה היא בדרך כלל קישור הכרחי לבקרת איכות בשלב הראשון בניסויים בחומצות גרעין.

איור 1. ספקטרום ספיגת RNA/DNA טיפוסי

02 אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז

בנוסף לטוהר, שלמות ה-RNA היא גם אחד המדדים החשובים לשיפוט איכות ה-RNA.הפירוק של ה-RNA יוביל למספר רב של שברים קצרים בדגימה, כך שמספר שברי ה-RNA שניתן לזהות ולכסות ביעילות על ידי רצף הייחוס יקטן.ניתן לבדוק את שלמות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ה-RNA הכולל על ג'ל אגרוז 1%.שיטה זו יכולה להגדיר את הג'ל בעצמך, או להשתמש במערכת E-Gel™ הטרומית לבדיקת תקינות.יותר מ-80% מסך ה-RNA הוא RNA ריבוזמלי, שרובו מורכב מ-28S ו-18S rRNA (במערכות יונקים).RNA באיכות טובה יציג שני פסים בהירים ברורים, שהם פסים בהירים של 28S ו-18S, בהתאמה, ב-5 Kb ו-2 Kb, והיחס יטוה להיות קרוב ל-2:1.אם הוא במצב מפוזר, זה אומר שייתכן שדגימת ה-RNA נפלה, ומומלץ להשתמש בשיטה שתוארה בהמשך כדי לבדוק עוד את איכות ה-RNA.

איור 2. השוואה בין RNA מושפל (מסלול 2) ושלם (מסלול 3) על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז

03 Agilent Bioanalyzer

בנוסף לשיטת האלקטרופורזה של ג'ל agarose שתוארה לעיל, שיכולה לעזור לנו לזהות את שלמות ה-RNA בפשטות ובמהירות, אנו יכולים גם להשתמש ב-Agilent bioanalyzer כדי לקבוע את שלמות ה-RNA.הוא משתמש בשילוב של מיקרו-נוזלים, אלקטרופורזה נימית וקרינה כדי להעריך ריכוז ושלמות RNA.על ידי שימוש באלגוריתם המובנה כדי לנתח את הפרופיל של דגימת ה-RNA, ה-Agilent bioanalyzer יכול לחשב ערך של שלמות RNA ייחוס, RNA Integrity Number (להלן RIN) [1].ככל שהערך של RIN גדול יותר, כך שלמות ה-RNA גבוהה יותר (1 מושפל מאוד, 10 הוא השלם ביותר).כמה ניסויים הכוללים RNA מציעים להשתמש ב- RIN כפרמטר להערכת איכות.בהסתמך על ניסויי רצף בתפוקה גבוהה (להלן כ-NGS) כדוגמה, ההנחיות של Oncomine™ Human Immune Repertoire, המשמשת לאיתור קולטני אנטיגן של תאי B ו-T בסדרת פאנל Oncomine של Thermo Fisher, מצביעות על כך שדגימות עם ערכי RIN גדולים מ-4, ניתן למדוד ולעשות clones יעיל יותר (Fines).ישנם טווחים מומלצים שונים עבור לוחות שונים, ולעתים קרובות RIN גבוה יותר יכול להביא נתונים יעילים יותר.

איור 3, בניסויים של Oncomine™ Human Immune Repertoire, דגימות עם RIN גדול מ-4 יכולות לזהות קריאות אפקטיביות יותר ושיבוטים של תאי T.【2】

עם זאת, לערך RIN יש גם כמה מגבלות.למרות של-RIN יש מתאם גבוה עם איכות הנתונים הניסיוניים של NGS, הוא אינו מתאים לדגימות FFPE.דגימות FFPE טופלו כימית במשך זמן רב, ול-RNA המופק יש בדרך כלל ערך RIN נמוך יחסית.עם זאת, זה לא אומר שהנתונים האפקטיביים של הניסוי חייבים להיות לא מספקים.כדי להעריך במדויק את האיכות של דגימות FFPE, עלינו להשתמש במדידות שאינן RIN.בנוסף ל-RIN, Agilent bioanalyzer יכול גם לחשב את ערך DV200 כפרמטר הערכה של איכות RNA.DV200 הוא פרמטר שמחשב את השיעור של קטעים גדולים מ-200 bp בדגימת RNA.DV200 הוא אינדיקטור טוב יותר לאיכות דגימת FFPE מאשר RIN.עבור ה-RNA המופק על ידי FFPE, יש לו מתאם גבוה מאוד עם מספר הגנים שניתן לזהות ביעילות ולמגוון הגנים [3].למרות ש-DV200 יכול לפצות על הליקויים בזיהוי האיכות של FFPE, הביואנליזר Agilent עדיין לא יכול לנתח באופן מקיף את בעיות האיכות בדגימות RNA, כולל האם יש מעכבים בדגימות.מעכבים עצמם יכולים להשפיע על יעילות ההגברה של ניסויים במורד הזרם ולהפחית את כמות הנתונים השימושיים.כדי לדעת אם יש מעכב בדגימה, נוכל לאמץ את שיטת ה-PCR הכמותית הפלורסנטית בזמן אמת המתוארת בהמשך.

04 PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת

שיטת ה-PCR הכמותית הפלורסנטית בזמן אמת יכולה לא רק לזהות את המעכבים בדגימה, אלא גם לשקף במדויק את איכות ה-RNA בדגימת FFPE.בהשוואה לניתוחים ביולוגיים Agilent, מכשירים כמותיים הקרינה בזמן אמת פופולריים יותר במעבדות ביולוגיות גדולות בשל היישום הרחב יותר.כדי לבדוק את האיכות של דגימות RNA, עלינו רק לרכוש או להכין בדיקות פריימר לגנים פנימיים, כגון GUSB (מספר חתולים Hs00939627).על ידי שימוש בסט זה של פריימרים, בדיקות וסטנדרטים (סה"כ RNA של ריכוז ידוע) לביצוע ניסויים כמותיים מוחלטים, ניתן לחשב את ריכוז שברי ה-RNA היעיל כסטנדרט ההערכה של איכות ה-RNA (קיצור Functional RNA Quantitation (FRQ)).בבדיקת NGS, מצאנו של-FRQ של דגימות RNA יש מתאם גבוה מאוד עם נפח הנתונים האפקטיבי.עבור כל הדגימות הגבוהות מ-0.2ng/uL FRQ, לפחות 70% מהקריאות יכולות לכסות ביעילות את רצף ההתייחסות (איור 4).

איור 4, לערך FRQ שזוהה בשיטה כמותית הקרינה יש מתאם גבוה מאוד (R2>0.9) עם הנתונים היעילים שהושגו בניסוי NGS.הקו האדום הוא ערך FRQ השווה ל-0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

בנוסף להיותה ישים לדגימות FFPE, שיטת ה-PCR הכמותית בזמן אמת יכולה גם לנטר ביעילות מעכבים בדגימות.אנו יכולים להוסיף את הדגימה שתתגלה למערכת התגובה עם בקרה חיובית פנימית (IPC) והבדיקה שלה, ולאחר מכן לבצע כימות הקרינה כדי לקבל את ערך ה-Ct.אם ערך Ct מפגר אחרי ערך Ct בתגובה ללא דגימה, זה מצביע על כך שהמעכב קיים בדגימה ומעכב את יעילות ההגברה בתגובה.

05 שיטת צבע פלואורסצנטי של קוביט

קוביט פלואורומטר הוא המכשיר הקטן הנפוץ ביותר לזיהוי ריכוז וטוהר חומצות גרעין, שקל לתפעול וקיים כמעט בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית.הוא מחשב במדויק את ריכוז חומצת הגרעין על ידי זיהוי וצבע פלואורסצנטי קושר חומצת גרעין (ריאגנט לגילוי קוביט).ל-Qubit יש רגישות וסגוליות גבוהות, והוא יכול לכמת במדויק RNA עד לריכוז pg/µL.בנוסף ליכולת הידועה לכמת במדויק את ריכוז חומצת הגרעין, הדגם החדש האחרון של Thermo Fisher, Qubit 4.0, יכול גם לזהות את שלמות ה-RNA.מערכת זיהוי ה-RNA של Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) מזהה את שלמות ה-RNA על ידי זיהוי בו-זמנית של שני צבעים פלורסנטים ספציפיים.שני צבעים פלורסנטים אלה יכולים להיקשר לשברים גדולים ולשברים קטנים של RNA, בהתאמה.שני צבעי פלורסנט אלו מצביעים על חלקם של שברי רנ"א גדולים בדגימה, ומתוך כך ניתן לחשב את ערך ה-IQ (שלמות ואיכות) המייצג את איכות ה-RNA.ערך ה-IQ חל הן על דגימות FFPE והן על דגימות שאינן FFPE, ויש לו השפעה רבה על איכות הרצף שלאחר מכן.אם לוקחים ניסויי NGS כדוגמה, בניסויי בדיקת RNA-Seq שבוצעו בפלטפורמת Ion torrent™, לרוב הדגימות עם ערכי IQ גדולים מ-4 היו לפחות 50% קריאות אפקטיביות (איור 5).בהשוואה לשיטות הזיהוי שהוזכרו לעיל, Qubit IQ Assay לא רק נוח יותר לתפעול ולוקח פחות זמן (בתוך חמש דקות), אלא גם בעל מתאם מצוין בין ערך הפרמטר IQ הנמדד לאיכות הנתונים של ניסויים במורד הזרם.

איור 5, יש מתאם גדול בין ערך Qubit RNA IQ לבין הקריאות הממופות של RNA-Seq.【5】

דרך ההקדמה לעיל, אני מאמין שלכל אחד יש הבנה מספקת של שיטות בקרת איכות RNA שונות.בפועל, אתה יכול לבחורהשיטה המתאימה לפי סוג המדגם והמכשירים הקיימים.רק על ידי שליטה טובה באיכות ה-RNA נוכל למנוע את הכישלון של הניסויים הבאים שנגרמו מאיכות דגימה ירודה, ובכך לחסוך זמן יקר, אנרגיה ועלות.

מוצרי ייחוס:

ערכת בידוד כולל RNA של בעלי חיים

ערכת בידוד RNA כוללת של תאים

הפניות

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.ה-RIN: מספר שלמות RNA להקצאת ערכי שלמות למדידות RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 מדריך למשתמש של Oncomine Human Immune Immune Repertoire (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessment RNA Derivate from Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 179, August 3–70, עמוד 3-70https://doi.org/10.1093/toxsci/