עיקור קצות פיפטה וצינורות EP וכו'.

1. הכן 0.1% (אלפית) DEPC (חומר רעיל ביותר) עם מים מופחתים, השתמש בו בזהירות במנדף ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס הרחק מאור;

מי DEPC הם מים טהורים שטופלו ב-DEPC ומעוקרים על ידי טמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה.נבדק נקי מ-RNase, DNase ופרוטאין.

2. הכניסו את קצה הפיפטה ואת צינור ה-EP לתוך 0.1% DEPC, וודא שקצה הפיפטה וצינור ה-EP מלאים ב-0.1% DEP.

3. הגן מפני אור, תן לעמוד, למשך הלילה (12-24 שעות)

4. אין צורך להשרות את הקופסה המכילה את הקצה וצינור ה-EP ב-DEPC.לאחר הסרה גסה של מי ה-DEPC בקצה או בצינור ה-EP, ארוז אותו ועטוף אותו.

5. 121 מעלות צלזיוס, 30 דקות

6. 180 מעלות צלזיוס, יבש למספר שעות (לפחות 3 שעות)

הערה: א.ללבוש כפפות ומסכות לטקס בעת הטיפול ב-DEPC!ב, או ללא עיקור DEPC, 130 ℃, אוטוקלאב של 90 דקות (עקור מעבדות רבות בטמפרטורה גבוהה פעמיים)

שיקולי מיצוי RNA

שתי תופעות עיקריות של כשל בידוד RNA של רקמות

פירוק RNA ושאריות של זיהומים ברקמות,לגבי השפלה, בואו נסתכל תחילה מדוע RNA המופק מתאי תרבות אינו מתכלה בקלות.ריאגנטים לחילוץ RNA קיימים כולם מכילים רכיבים המעכבים במהירות RNase.הוסף את הליזאט לתאים התורבתים, ופשוט לערבב אותו, ניתן לערבב היטב את כל התאים עם הליזאט, והתאים עוברים ליטוש מוחלט.לאחר הליזה של התאים, החומרים הפעילים בליזט מעכבים מיד את ה-RNase התוך-תאי, כך שה-RNA נשאר שלם.כלומר, מכיוון שהתאים המתורבתים יוצרים מגע בקלות ובאופן מלא עם הליזאט, ה-RNA שלהם אינו מתכלה בקלות;מצד שני, ה-RNA ברקמה מתכלה בקלות מכיוון שלא קל ליצור קשר מהיר עם התאים ברקמה.עקב מגע מספק.כך,בהנחה שיש דרך להפוך את הרקמה לתא בודד תוך עיכוב פעילות ה-RNA, ניתן לפתור לחלוטין את בעיית הפירוק.

טחינת חנקן נוזלי היא השיטה היעילה ביותר מסוג זה.עם זאת, שיטת טחינת החנקן הנוזלי מטרידה מאוד, במיוחד כאשר מספר הדגימות גדול.זה הוליד את הדבר הטוב הבא: ההומוגנייזר.הhomogenizerהשיטה אינה בוחנת את השאלה כיצד מעכבת פעילות RNase לפני יצירת מגע בין תאים עם ה-lysate, אלא מתפללת שקצב השיבוש של הרקמה מהיר יותר מהקצב שבו RNase תוך תאי מפרק RN.

ההשפעה של הומוגגניזטור חשמלי טובה יותר,וההשפעה של הומוגניזטור זכוכית גרועה, אך באופן כללי, שיטת ההומוגגניזטור אינה יכולה למנוע את תופעת ההשפלה.לכן, אם המיצוי מתקלקל, יש להשתמש בהומוגגניזר החשמלי המקורי לטחינה עם חנקן נוזלי;יש לשנות את ההומוגגניזטור המקורי מזכוכית להומוגנית חשמלית או לטחון ישירות עם חנקן נוזלי.הבעיה היא כמעט 100% ריאלית.לקבל פתרון.

לבעיית שאריות הטומאה המשפיעה על הניסויים הבאים יש סיבות מגוונות יותר מאשר השפלה, והפתרונות שונים בהתאם.לסיכום,אם יש פירוק או זיהומים שיוריים ברקמה, יש לייעל את שיטת המיצוי/ריאגנט לחומר הניסוי הספציפי.אתה לא צריך להשתמש בדגימות היקרות שלך לאופטימיזציה: אתה יכול לקנות כמה חיות קטנות כמו דגים/עוף מהשוק, לקחת את החלק המתאים של החומר למיצוי RNA, ואת החלק השני למיצוי חלבון - לטחון עם תמצית הפה, הקיבה והמעיים.

RNA המטרה של ה-RNA המופק משמש לניסויי מעקב שונים, ודרישות האיכות שלו שונות

בניית ספריית cDNA דורשת שלמות RNA ללא שאריות של מעכבי תגובה אנזים;Northern דורש שלמות RNA גבוהה יותר ודרישות נמוכות יותר לשאריות מעכבי תגובה אנזים;RT-PCR אינו דורש שלמות RNA גבוהה מדי,אבל מעכב תגובות אנזימים.דרישות שאריות הן מחמירות.הקלט קובע את הפלט;בכל פעם שהמטרה היא להשיג את ה-RNA הטוהר ביותר, זה יעלה לאנשים וכסף.

איסוף/אחסון דוגמאות

גורמים המשפיעים על פירוק לאחר שהדגימה עוזבת את הגוף החי/או מסביבת הגידול המקורית, האנזימים האנדוגניים בדגימה יתחילו לפרק RNA,וקצב הפירוק קשור לתכולת האנזימים האנדוגניים ולטמפרטורה.באופן מסורתי, יש רק שתי דרכים לעכב לחלוטין את פעילות האנזים האנדוגני: הוסף ליזאט מיד והומוגגן באופן יסודי ומהיר;לחתוך לחתיכות קטנות ולהקפיא מיד בחנקן נוזלי.שתי הגישות דורשות פעולה מהירה.האחרון מתאים לכל הדגימות, בעוד שהראשונה מתאימה רק לרקמות עם תכולה נמוכה של תאים ואנזימים אנדוגניים וקל יותר להומוגג.באופן ספציפי, רקמות צמחיות, כבד, תימוס, לבלב, טחול, מוח, שומן, רקמת שריר וכו' עדיף להקפיא בחנקן נוזלי לפני שתמשיך.

פיצול והומוגניזציה של דגימות

גורמים המשפיעים על פירוק ותשואה פיצול מדגם הואלהומוגיזציה יסודית, המיועד לשחרור מלא ומלא של RNA.ניתן להומוג תאים ישירות מבלי להישבר.ניתן להומוג את הרקמות רק לאחר שנשברו.יש לשבור שמרים וחיידקים באמצעות אנזימים מתאימים לפני שניתן יהיה להומוג אותם.רקמות בעלות תכולת אנזימים אנדוגניים נמוכה יותר והומוגניזציה קלה יותר ניתנות לכתוש ולהומוגג בבת אחת ב-lysate על ידי הומוגנייזר;רקמות צמחיות, כבד, תימוס, לבלב, טחול, מוח, שומן, רקמת שריר ודגימות אחרות, הן עשירות באנזימים אנדוגניים או שאינן מתאימות בקלות,כך שיבוש רקמות והומוגניות חייבות להתבצע בנפרד.שיטת הפיצול האמינה והפרודוקטיבית ביותר היא כרסום בחנקן נוזלי, והשיטה האמינה ביותר להומוגניזציה היא השימוש בהומוגגניזר חשמלי.הערה מיוחדת לגבי טחינה עם חנקן נוזלי: אסור להפשיר את הדגימה במהלך כל תהליך הטחינה, מכיוון שאנזימים אנדוגניים נוטים יותר לתפקד בהקפאה.

בחירה של lysate

משפיע על נוחות הפעולה ועל הגורמים של שאריות זיהומים אנדוגניים פתרונות התמוגה הנפוצים יכולים כמעט לעכב את הפעילות של RNase.לכן, נקודת המפתח של בחירת פתרון תמוגה היא לשקול בשילוב עם שיטת הטיהור.יש חריג אחד:דגימות עם תכולת אנזימים אנדוגניים גבוהה מומלץ להשתמש בליזט המכיל פנול כדי להגביר את היכולת להשבית אנזימים אנדוגניים.

בחירת שיטת טיהור

גורמים המשפיעים על שאריות זיהומים אנדוגניים, מהירות מיצוי עבור דגימות נקיות כגון תאים, ניתן להשיג תוצאות משביעות רצון כמעט בכל שיטת טיהור בהישג יד.אבל עבור דגימות רבות אחרות, במיוחד אלו עם רמות גבוהות של זיהומים כגון צמחים, כבד, חיידקים וכו', בחירת שיטת טיהור מתאימה היא קריטית.לשיטת הטיהור הצנטריפוגלי של העמודים יש מהירות מיצוי מהירה ויכולה להסיר ביעילות זיהומים המשפיעים על התגובה האנזימטית של RNA, אך היא יקרה (Foregene יכולה להציע ערכות חסכוניות, לפרטים נוספים לחץכאן);שימוש בשיטות טיהור חסכוניות וקלאסיות, כמו משקעי LiCl, יכולים גם הם להשיג תוצאות משביעות רצון, אך זמן הפעולה ארוך..

"שלוש דיסציפלינות ושמונה תשומת לב" למיצוי RNA

תחום 1:לשים קץ לזיהום של אנזימים אקסוגניים.

הערה 1:הקפידו ללבוש מסכות וכפפות.

פתק 2:יש להשליך ביסודיות את צינורות הצנטריפוגה, ראשי הקצה, מוטות הפיפטה, מיכלי האלקטרופורזה והספסלי הניסוי המעורבים בניסוי.

פתק 3:הריאגנטים/הפתרונות המעורבים בניסוי, במיוחד מים, חייבים להיות נטולי RNase.

תחום 2:חסימת הפעילות של אנזימים אנדוגניים

הערה 4:בחר שיטת הומוגניזציה מתאימה.

הערה 5:בחר lysate מתאים.

הערה 6:שליטה בכמות ההתחלתית של המדגם.

תחום 3:הבהירו את מטרת החילוץ שלכם

הערה 7:עם כל מערכת lysate מתקרבת לכמות ההתחלתית המקסימלית של דגימה, שיעור הצלחת המיצוי יורד בחדות.

הערה 8:הקריטריון הכלכלי היחיד למיצוי RNA מוצלח הוא הצלחה בניסויים הבאים, לא תשואה.

10 המקורות המובילים לזיהום RNase

1. אצבעות הן המקור הראשון לאנזימים אקסוגניים, ולכן יש ללבוש כפפות ולהחליף בתדירות גבוהה.בנוסף, יש ללבוש גם מסכות, כי גם הנשימה היא מקור חשוב לאנזימים.יתרון נוסף של חבישת מסיכת כפפות הוא להגן על הנסיין.

2. קצות פיפטה, שפופרות צנטריפוגות, פיפטות – לא ניתן להשבית את RNase על ידי עיקור בלבד, לכן יש לטפל בקצות פיפטה ובצינורות צנטריפוגות ב-DEPC, גם אם הם מסומנים כ-DEPC שטופלו.עדיף להשתמש בפפטה למטרות מיוחדות, לנגב אותה עם צמר גפן 75% אלכוהול לפני השימוש, במיוחד את המוט;בנוסף, הקפידו לא להשתמש במסיר ראש.

3. המים/המאגר חייבים להיות נקיים מזיהום RNase.

4. יש לנגב לפחות את שולחן הבדיקה בעזרת כדורי צמר גפן 75% אלכוהול.

5. RNase אנדוגני כל הרקמות מכילות אנזימים אנדוגניים, כך שהקפאה מהירה של רקמות עם חנקן נוזלי היא הדרך הטובה ביותר להפחית את הפירוק.שיטת אחסון/טחינה של חנקן נוזלי אמנם לא נוחה, אבל זו הדרך היחידה לרקמות עם רמות גבוהות של אנזימים אנדוגניים.

6. דגימות RNA מוצרי מיצוי RNA עשויים להכיל עקבות של זיהום RNase.

7. מיצוי פלסמיד מיצוי פלסמיד משתמש לעתים קרובות ב-RNase כדי לפרק את RNA, ואת השארית של RNAse יש לעכל עם Proteinase K ולחלץ על ידי PCI.

8. אחסון RNA גם אם הוא מאוחסן בטמפרטורה נמוכה, כמויות עקבות של RNase יגרמו לפירוק RNA.הפתרון הטוב ביותר לשימור ארוך טווח של RNA הוא תרחיף מלח/אלכוהול, מכיוון שאלכוהול מעכב את כל הפעילות האנזימטית בטמפרטורות נמוכות.

9. כאשר קטיונים (Ca, Mg) מכילים יונים אלו, חימום ב-80C למשך 5 דקות יגרום לפירוק RNA, כך שאם צריך לחמם RNA, תמיסת השימור צריכה להכיל חומר קלאט (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. אנזימים המשמשים בניסויים הבאים עשויים להיות מזוהמים על ידי RNase.

10 טיפים למיצוי RNA

1: למנוע במהירות פעילות RNase.דגימות מוקפאות במהירות לאחר איסוף, ו-RNase מושבת על ידי פעולה מהירה במהלך תמוגה.

2: בחרו שיטת מיצוי מתאימה לרקמה עם תכולת ריבוזים גבוהה, ורקמת שומן עדיף להשתמש בשיטה המכילה פנול.

3: איכות חיזוי דורשת Northern, בניית ספריית cDNA דורשת שלמות גבוהה, ו-RT-PCR ו-RPA (מבחן הגנת Ribonuclease) אינם דורשים שלמות גבוהה.RT-PCR דורש טוהר גבוה (שאריות מעכבי אנזים).

4: הומוגיזציה יסודית היא המפתח לשיפור התפוקה והפחתת השפלה.

5: בדוק את שלמות זיהוי אלקטרופורזה של RNA, 28S: 18S = 2: 1 הוא סימן שלם, 1: 1 מקובל גם עבור רוב הניסויים.

6: הסרת DNA עבור RT-PCR, ניתוח מערך עדיף להשתמש ב-Dnase I כדי להסיר DNA.

7: צמצם את הזיהום של אנזימים אקסוגניים - לא ניתן לייבא אנזימים מבחוץ.

8: בעת ריכוז חומצת גרעין בריכוז נמוך, יש להוסיף מגיב משקעים משותף.אבל כדי למנוע את המשקע המשותף המכיל אנזימים וזיהום DNA.

9: ממיסים היטב את ה-RNA, אם יש צורך, מחממים ב-65C למשך 5 דקות.

שיטת אחסון מתאימה

ניתן לאחסן אותו ב-20C לזמן קצר, וב-80C לזמן ארוך.הצעד הראשון בשיפור תשואות ה-RNA הוא להבין שתכולת ה-RNA של דגימות שונות משתנה מאוד.שפע גבוה (2-4 ug/mg) כגון כבד, לבלב, לב, שפע בינוני (0.05-2ug/mg) כגון מוח, עובר, כליה, ריאות, תימוס, שחלה, שפע נמוך (<0.05 ug/mg) מ"ג) כגון שלפוחית ​​השתן, עצמות, שומן.

1: ליזה תאים לשחרור RN - אם RNA לא משתחרר, התשואה תפחת.הומוגניזציה חשמלית עובדת טוב יותר משיטות הומוגניות אחרות, אך ייתכן שיהיה צורך לשלב אותה עם שיטות אחרות, כגון ריסוק חנקן נוזלי, עיכול אנזימטי (Lysozyme/Lyticase)

2: אופטימיזציה של שיטת המיצוי.הבעיות הגדולות ביותר בשיטות מבוססות פנול הן ריבוד לא שלם ואובדן RNA חלקי (לא ניתן להסיר את הסופרנטנט לחלוטין).ריבוד לא שלם נובע מתכולת חומצות גרעין וחלבונים גבוהות, אשר ניתן לפתור על ידי הגדלת כמות הליזאט בשימוש או הפחתת כמות הדגימה.שלב של מיצוי כלורופורם נוסף לרקמת השומן.ניתן להפחית אובדן RNA על ידי שאיבה חזרה או על ידי הסרת השכבה האורגנית ולאחר מכן צנטריפוגה.הבעיה הגדולה ביותר בשיטות המבוססות על צנטריפוגה עמודות היא עודף מדגם.

טיפים לחילוץ קלאסיים

1. טיהור פנול: מוסיפים נפח שווה של 1:1 פנול/כלורופורם ומערבבים במרץ במשך 1-2 דקות.צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 2 דקות.הסר בזהירות את הסופרנטנט (80-90%).לעולם אל תגיע לשכבה האמצעית.ניתן להוסיף נפח שווה של תמיסת התגובה לפנול/כלורופורם ולהסיר את הסופרנטנט.ניתן לערבב את שני הסופרנטנטים יחד עבור משקעים של חומצת גרעין כדי לשפר את התשואה.אל תהיו עדינים מדי בערבוב, ואל תנסו להסיר את כל הסופרנטנט.

2. כביסה עם 70-80% אתנול: במהלך הכביסה יש להשעות את חומצת הגרעין כדי להבטיח ששאריות המלח נשטפות.במקביל, מיד לאחר שפיכת האתנול, צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך מספר שניות, ולאחר מכן הסר את שארית האתנול בעזרת פיפטה.ממיסים לאחר העמידה בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.

11. מיצוי ארגונים מיוחדים

1. רקמה סיבית: המפתח למיצוי RNA מרקמות סיבית כמו לב/שריר השלד הוא לשבש לחלוטין את הרקמה.לרקמות אלו יש צפיפות תאים נמוכה, ולכן כמות ה-RNA ליחידת משקל רקמה נמוכה, ועדיף להשתמש בכמות התחלתית רבה ככל האפשר.הקפידו לטחון את הרקמה ביסודיות בתנאי הקפאה.

2. רקמות בעלות תכולת חלבון/שומן גבוהה: תכולת שומן במוח/צמחית גבוהה.לאחר מיצוי PCI, הסופרנטנט מכיל פקקים לבנים.יש לחלץ מחדש את הסופרנטנט עם כלורופורם.

3. רקמות עם תכולת חומצת גרעין/ריבוזים גבוהה: לטחול/תימוס יש תכולת חומצות גרעין וריבוזים גבוהות.טחינת רקמה בתנאי הקפאה ואחריה הומוגניזציה מהירה יכולה למעשה להשבית ריבוזימים.עם זאת, אם הליזאט צמיג מדי (בשל תכולת חומצת גרעין גבוהה), מיצוי ה-PCI לא יוכל לרבד ביעילות;הוספת ליסט נוסף יכולה לפתור בעיה זו.עקירות PCI מרובות יכולות להסיר עוד שיורי DNA.אם נוצר משקע לבן מיד לאחר הוספת אלכוהול, זה מצביע על זיהום DNA.חילוץ מחדש עם PCI חומצי לאחר פירוק יכול להסיר זיהום DNA.

4. רקמת צמחים: רקמת צמחים מורכבת יותר מרקמת בעלי חיים.בדרך כלל, צמחים נטחנים בתנאי חנקן נוזלי, ולכן פירוק RNA על ידי אנזימים אנדוגניים אינו שכיח.אם בעיית הפירוק לא נפתרת, היא נגרמת כמעט בוודאות על ידי זיהומים הכלולים בדגימה.הזיהומים הכלולים בצמחים רבים יובילו לשאריות, והסיבה לשאריות היא לעתים קרובות משום שלזיהומים אלו יש קווי דמיון עם RNA: אתה משקע ואני משקע, ואתה סופח ואני סופח.מאפיינים אלה קובעים שהם מעכבי אנזימים חזקים מאוד.

כיום, ניתן להתאים ריאגנטים מסחריים למיצוי RNA כמעט לכל רקמות החיות עם התאמות קטנות, אך ישנם מעט ריאגנטים מסחריים למיצוי RNA שיכולים להתאים לרוב רקמות הצמח.למרבה המזל, Foregene יכול לספק מיוחדערכות מיצוי RNA לצמחים, יש לנוערכת בידוד כולל RNA של צמחים, Kit Total RNA Isolation Plant Plus.האחרון תוכנן במיוחד עבור צמחים בעלי תכולת פוליסכרידים ופוליפנולים גבוהים.עבור מיצוי RNA, משוב ממשתמשי מעבדה הוא טוב במיוחד.

12. השפעת הקפאת הדגימה והפשרה הדגימה הקפואה עשויה להיות גדולה יותר, ויש לחתוך אותה לפני השימוש למיצוי RNA.דגימות נוטות להימס (אולי חלקית) במהלך החיתוך.ייתכן שיהיה צורך לשקול דגימות קפואות לפני מיצוי RNA, והפשרה בהחלט תתרחש במהלך תהליך זה.לעיתים, הפשרת הדגימה מתרחשת גם בתהליך טחינת החנקן הנוזלי;או שהדגימה הקפואה מתווספת ישירות לליזאט ללא טחינת חנקן נוזלי, והפשרה בהחלט תתרחש לפני ההומוגניזציה המלאה.ניסויים הראו שרקמה קפואה נוטה יותר לפירוק RNA במהלך הפשרה מאשר רקמה טרייה.הסיבה הסבירה: תהליך ההקפאה-הפשרה משבש מבנים בתוך התא, ומקל על אנזימים אנדוגניים לבוא במגע ישיר עם ה-RNA.

13. שיפוט של איכות RNA בדרך כלל, אלקטרופורזה משמשת כדי לשפוט את שלמות ה-RNA, ו-A260/A280 משמשת לשפוט את טוהר ה-RNA.בתיאוריה, ל-RNA שלם יש יחס של 28S:18S = 2.7:1, ורוב הנתונים מדגישים את היחס של 28S:18S = 2:1.העובדה היא שכמעט אף אחד מה-RNA המופק מדגימות מלבד תאים אינו נמצא ביחס של 2:1 (זה התקבל באמצעות ה-Agilent Bioanalyzer).

תוצאות האלקטרופורזה של RNA מושפעות מגורמים רבים, כולל מבנה משני, תנאי אלקטרופורזה, עומס מדגם, דרגת הרוויה על ידי EB וכו'. השתמש באלקטרופורזה מקורית כדי לזהות RNA והשתמש ב-DNA Marker כבקר.אם ה-28S ב-2kb וה-18S ב-0.9kb ברורים, ו-28S: 18S > 1, השלמות יכולה לעמוד בדרישות של רוב הניסויים הבאים.

A260/A280 הוא אינדיקטור שגרם לבלבול רב.קודם כל, יש צורך להבהיר את המשמעות המקורית של אינדיקטור זה לחומצות גרעין: RNA טהור, A260/280 שלו = בערך 2.0.RNA טהור הוא ה'סיבה' ו-A260/A280 = 2 הוא ה'אפקט'.כעת כולם משתמשים ב-A260/A280 כ'סיבה', וחושבים ש"אם A260/A280 = 2, אז ה-RNA הוא טהור", מה שמוביל באופן טבעי לבלבול.

אם אתה מעוניין, אתה יכול להוסיף לדגימת ה-RNA שלך מעט מגיב המשמש לעתים קרובות למיצוי, כגון פנול, גואנידין איזותיוציאנט, PEG וכו', ולאחר מכן למדוד את היחס A260/A280.המציאות היא שרבים מהריאגנטים המשמשים למיצוי RNA, כמו גם זיהומים רבים בדגימה, סופגים סביב A260 ו-A280, ומשפיעים על A260/A280.

הגישה המאלפת ביותר כיום היא סריקת דגימות RNA בטווח של 200-300 ננומטר.לעקומה של RNA טהור יש את המאפיינים הבאים: העקומה חלקה, A230 ו-A260 הן שתי נקודות פיתול, A300 קרוב ל-0, A260/A280 = סביב 2.0, ו-A260/A230 = סביב 2.0.אם אין נתוני סריקה זמינים, יש לקבוע גם את היחס A260/A230, שכן יחס זה רגיש יותר להעברת כל הזיהומים המשפיעים על התגובה האנזימטית.קח בחשבון את הטווח הליניארי של המכשיר (0.1-0.5 עבור A260).

ישנן שתי תופעות שימושיות נוספות: היחס יהיה נמוך בכ-0.3 כאשר A260/A280 נמדד במים;בעוד שהיחס הנמדד ב-10 mM EDTA גבוה בכ-0.2 מזה הנמדד ב-1 mM EDTA.

מוצרים קשורים:

יצרן וספק ערכת בידוד RNA Total RNA Plant |Foregene (foreivd.com)

סדרת בידוד RNA ספקים ומפעל |יצרני סדרת בידוד RNA בסין (foreivd.com)

סדרת בידוד RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)