ספציפיות של זיהוי
ברוב המקרים, המטרה של עיצוב פריימר היא למקסם את הספציפיות של PCR.זה נקבע על ידי ההשפעה הניתנת לחיזוי פחות או יותר של משתנים רבים.משתנה חשוב אחד הוא הרצף בקצה 3′ של הפריימר.
חשוב לציין, מבחני PCR המיועדים לספציפיות נוטים יותר לשמור על יעילות גבוהה בטווח דינמי רחב, מכיוון שהניסוי אינו מייצר תוצרי הגברה לא ספציפיים, ובכך מתחרים עם ריאגנטים PCR או מעכב את תגובת ההגברה העיקרית.
כמובן שבמקרים מסוימים, הספציפיות אינה החשובה ביותר, למשל, כאשר המטרה היא לכמת פתוגנים קשורים אך שונים, נדרשים תקני עיצוב, אופטימיזציה ואימות מיוחדים.
עקומת ההיתוך היא שיטה סטנדרטית להערכת הספציפיות של אמפליקונים, לפחות מבחינת האם להגביר מטרה בודדת.עם זאת, יש להדגיש כי עקומות ההיתוך עלולות להיות מטעות מכיוון, למשל, הן יכולות להיות מושפעות מהשפעות משולבות של פריימרים לא אופטימליים וריכוזי תבנית נמוכים.
P5 |עקומת ההיתוך מציגה את שינויי ה-Tm המתקבלים משתי גילויים של כמויות שונות של שני DNAs מטרה.
א בריכוזים גבוהים יותר (ad)), אין דימר פריימר ברור לאחר השלמת מדידת ה-qPCR.כאשר ריכוז התבנית יורד ל-50 עותקים (ה), מוצר לא ספציפי מתחיל להופיע והופך למוצר היחיד בריכוז הנמוך ביותר (ו).
ב. הבדיקה רשמה את אותו Tms בכל ריכוזי היעד, ולא היה דימר פריימר ברור אפילו בריכוז הנמוך ביותר (5 עותקים).בעת שימוש בשתי שיטות הזיהוי הללו, לא זוהו מוצרי הגברה ב-NTCs.
P5 מציג את עקומות הפירוק שהתקבלו עם דגימות בהן התבנית קיימת בריכוזים שונים.P 5a מראה שבשני הריכוזים הנמוכים ביותר, ה-Tms של מוצרי ההגברה הלא ספציפיים המיוצרים נמוכים מזו של האמפליקונים הספציפיים.
ברור שלא ניתן להשתמש בשיטת זיהוי זו באופן אמין כדי לזהות מטרות הקיימות בריכוזים נמוכים.
מעניין לציין כי NTCs, כלומר דגימות ללא DNA כלל, לא תיעדו תוצרי הגברה (לא ספציפיים), מה שמצביע על כך ש-DNA גנומי ברקע יכול להשתתף בהגברה/פילמור לא ספציפי.
לפעמים לא ניתן לתקן פריימר רקע כזה והגברה לא ספציפית, אך לעתים קרובות ניתן לתכנן שיטת זיהוי שאין לה הגברה לא ספציפית בכל ריכוז תבנית ו-NTC (P 5b).
כאן, אפילו רישום ההגברה של ריכוז המטרה עם Cq של 35 תיצור עקומת פירוק ספציפית.באופן דומה, NTCs לא הראו סימנים של הגברה לא ספציפית.לפעמים, התנהגות הגילוי עשויה להיות תלויה באלכוהול האם, ורק הגברה לא ספציפית מזוהה בהרכבי חיץ מסוימים, אשר עשויה להיות קשורה לריכוזי Mg2+ שונים.
יציבות הגילוי
האופטימיזציה של Ta היא שלב שימושי בתהליך האימות והאופטימיזציה האמפיריים של זיהוי qPCR.הוא מספק אינדיקציה ישירה לחוסן של ערכת הפריימר על ידי הצגת הטמפרטורה (או טווח הטמפרטורות) שמייצר את ה-Cq הנמוך ביותר מבלי להגביר את ה-NTC.
ההבדל ברגישות של פי שניים עד ארבע אולי לא חשוב עבור אנשים עם ביטוי mRNA גבוה, אבל עבור בדיקות אבחון, זה עשוי להיות ההבדל בין תוצאות חיוביות לשליליות כוזבות.
תכונות ה-Ta של פריימרים qPCR עשויות להשתנות מאוד.חלק מהבדיקות אינן חזקות במיוחד, ואם הן לא מבוצעות תחת ערך ה-Ta האופטימלי של הפריימרים, הן יקרסו במהירות.
זה חשוב מכיוון שסוג זה של זיהוי הוא לעתים קרובות בעייתי בעולם האמיתי, וטוהר הדגימה, ריכוז ה-DNA או הנוכחות של DNA אחר עשויים שלא להיות אופטימליים.
בנוסף, מספר עותק היעד עשוי להשתנות בטווח רחב, והריאגנטים, כלי הפלסטיק או המכשירים עשויים להיות שונים מאלה המשמשים בעת הגדרת הבדיקה.
P6|שיפוע הטמפרטורה מראה את החוסן השונה של זיהוי PCR.
א. השתמש ב-Sensifast SYBR mastermix של Bioline (מספר קטלוגי BIO-98050) כדי לבצע PCR על cDNA שהוכן מ-RNA של המוח האנושי.
ב. השתמש במכשיר CFX qPCR של Bio-Rad כדי להקליט את מפת ההגברה ועקומת הפירוק של אפלין (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
ג. גרף הגברה ועקומת ההיתוך של ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
ד. גרף הגברה ועקומת הפירוק של GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs שנרשם בטמפרטורות חישול שונות, המראה את ההבדל ב-Cq שנרשם תחת שיפוע טמפרטורה של 7C.
P 6 מראה תוצאה אופיינית של בדיקה לא רצויה, שבה qPCR בוצע באמצעות שיפוע Tas בין 59C ל-67C (P 6a), תוך שימוש בפריימרים עבור שלושה גנים ספציפיים למוח האנושי.
ניתן לראות מגרף ההגברה ש-Opalin primers רחוקים מלהיות אידיאליים מכיוון שטווח ה-Ta האופטימלי שלהם צר מאוד (איור 6b), כלומר, Cqs מפוזרים באופן נרחב, וכתוצאה מכך Cqs מושווים באופן משמעותי ל-Cqs Low האופטימלי שלהם.
שיטת זיהוי זו אינה יציבה ועלולה להוביל להגברה לא אופטימלית.לכן, יש לעצב מחדש זוג פריימרים זה.בנוסף, ניתוח עקומת ההיתוך (הכנס) מראה שגם הספציפיות של שיטת זיהוי זו עשויה להיות בעייתית, מכיוון שעקומת ההיתוך של כל טא שונה.
שיטת הזיהוי ACSBG1 המוצגת ב-P 6c חזקה יותר משיטת הזיהוי של Opalin לעיל, אך היא עדיין רחוקה מלהיות אידיאלית, וסביר להניח שניתן לשפר אותה.
עם זאת, נדגיש כי אין קשר הכרחי בין חוסן וספציפיות, מכיוון שעקומת הפירוק המופקת בשיטת זיהוי זו מציגה את אותו ערך שיא בכל ה-Tas (הוספה).
מצד שני, מבחן החוסן הרבה יותר סובלני, מייצר Cqs דומים במגוון רחב של Tas, כמו במבחן GFAP המוצג ב-P 6d.
ההבדל ב-Cqs המתקבל באותו טווח של 8 מעלות צלזיוס קטן מ-1, ועקומת הפירוק (הכנסה) מאשרת את מאפייני הזיהוי בטווח טמפרטורות זה.ראוי לציין שה-Tas המחושב וטווח ה-Ta בפועל עשויים להיות שונים מאוד.
ישנן קווים מנחים רבים שנועדו לסייע לחוקרים לעצב פריימרים יעילים, רובם מבוססים על כללים ותיקים ותשומת לב רבה ניתנה לקצה ה-3 של הפריימרים.לעתים קרובות מומלץ לכלול G או C בקצה 3' ושני בסיסים G או C (הדק GC), אך לא יותר משניים מתוך 5 הבסיסים האחרונים.
בפועל, כללים אלו יכולים להנחות חוקרים, אך הם לא בהכרח נכונים בכל הנסיבות.
P7 |לקצה ה-3 של הפריימר יש השפעה מועטה על הספציפיות או היעילות.
א. מיקום הפריימרים עבור הגן האנושי HIF-1α (NM_181054.2).
ב. השתמש באלכוהול אם ירוק Agilent Brilliant III SYBR (מספר קטגוריה 600882) כדי להגביר שישה פריטי בדיקה.
ג. גרף הגברה ועקומת ההיתוך שנרשמה על ידי מכשיר ה-CFX qPCR של Bio-Rad ו-3-end primers.NTCs מוצגים באדום.
D. Cqs רישום של כל פריט בדיקה
לדוגמה, התוצאה ב-P 7 סותרת את כלל 3′-end.כל העיצובים מייצרים בעצם את אותן תוצאות, כאשר רק שני שילובי פריימר מובילים להגברה לא ספציפית ב-NTC.
עם זאת, איננו יכולים לתמוך בהשפעה של קליפ GC, מכיוון שבמקרה זה, שימוש ב-A או T כמקסימום של 30 בסיסים אינו מפחית את הספציפיות.
מבחן C, שבו הפריימר F מסתיים ב-GGCC, אכן רשם Cqs ב-NTC, מה שמצביע על כך שאולי כדאי להימנע מרצפים אלה בקצה ה-30.אנו מדגישים שהדרך היחידה לקבוע את רצף 3'-קצה הטוב ביותר של זוג פריימר היא להעריך כמה פריימרים מועמדים בניסוי.
יעילות הגברה
חשוב לציין, למרות שזיהוי PCR לא ספציפי לעולם לא יכול להיות ספציפי, ניתן להתאים ולמקסם את יעילות ההגברה בדרכים רבות ושונות על ידי שינוי האנזים, משקאות האם, התוספים ותנאי המחזור.
כדי להעריך את היעילות של זיהוי PCR, עדיף להשתמש בדילול סדרתי של פי 10 או 5 מחומצת הגרעין היעד, כלומר, "שיטת העקומה הסטנדרטית".
אם נעשה שימוש באמפליקונים של PCR או מטרות DNA סינתטיות ליצירת עקומה סטנדרטית, יש לערבב דילולים סדרתיים של מטרות אלו עם כמות קבועה של DNA רקע (כגון DNA גנומי).
P8 |עקומת דילול להערכת היעילות של PCR.
א. השתמשו בפריימרים עבור HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ו-R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ו-Brillant III SYBR Green Mastermix של Agilent (מספר קטלוגי 600882) לתנאי PCR ועקומת התכה.
ב. RNA של 100 ננוגרם הועתק לאחור, דילול 2 פעמים, ודגימות cDNA בדילול סדרתי הודללו 5 פעמים ל-1 ng DNA גנומי אנושי.עקומת ההיתוך מוצגת בתוספת.
C. תגובת ה-RT, הדילול והדילול הסדרתי חזרו על עצמם עבור דגימת ה-cDNA השנייה, והתוצאות היו דומות.
P 8 מציג שתי עקומות סטנדרטיות, תוך שימוש באותה שיטת זיהוי על שתי דגימות cDNA שונות, התוצאה היא אותה יעילות, בערך 100%, וגם ערך R2 דומה, כלומר, מידת ההתאמה בין הנתונים הניסויים לקו הרגרסיה או הנתונים דרגת ליניאריות.
שתי העקומות הסטנדרטיות דומות, אבל לא בדיוק זהות.אם המטרה היא לכמת במדויק את היעד, יש לציין כי לא מקובל לספק חישוב מספר העתק מבלי להסביר את אי הוודאות
P9 |אי ודאות מדידה הקשורה לכימות באמצעות עקומה סטנדרטית.
א. השתמש בפריימרים עבור GAPDH (NM_002046) לביצוע PCR ותנאי עקומת התכה.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ו-R: TAACTGGTTGAGCACAGG ו-Sensifast SYBR מאסטרמיקס של Bioline (מספר קטלוגי BIO-98050).
ב. טבלת הגברה, עקומת התכה ועקומה סטנדרטית שנרשמה עם מכשיר ה-CFX qPCR של Bio-Rad.
ג. גרף עקומה סטנדרטית ו-95% רווח בר סמך (CI).
ד מספר ההעתקה ורווח סמך של 95% של שלושת ערכי Cq שנגזרו מעקומת הדילול.
P 9 מראה כי עבור בדיקה אופטימלית, השונות המובנית של עקומת תקן בודדת היא בערך פי 2 (95% רווח סמך, מינימום למקסימום), אשר עשויה להיות השונות הקטנה ביותר שניתן לצפות.
מוצרים קשורים:
זמן פרסום: 30 בספטמבר 2021
