ניסוי RT-qPCR כולל מיצוי RNA והערכת איכות, שעתוק הפוך ו-qPCR שלושה שלבים, לכל שלב יש הרבה אמצעי זהירות, נציג בפירוט בהמשך.

Ⅰ.הערכת איכות RNA

בניסוי RT-qPCR, לאחר השלמת מיצוי ה-RNA, יש להעריך את איכות ה-RNA, וניתן לבצע את ניסוי המעקב רק לאחר הסמכה.שיטות ההערכה כוללות ספקטרופוטומטר, אלקטרופורזה של ג'ל Agilent, ניתוח Agilent 2100, ביניהם הספקטרופוטומטר הנפוץ ביותר ושיטת אלקטרופורזה של אגרוז ג'ל.יש לציין כי יש להשתמש בשתי השיטות הללו יחד כדי להשלים את הזיהוי והניתוח של ריכוז, טוהר ושלמות RNA, על מנת להבטיח את איכות ה-RNA.

ערכת בידוד RNA קשורה: 

ערכת בידוד RNA כוללת של תאים

ניתן להשיג RNA כולל מטוהר ואיכותי מתאי תרבות שונים תוך 11 דקות.

ערכת בידוד כולל RNA של בעלי חיים

חילוץ מהיר ויעיל של RNA כולל בטוהר גבוה ואיכותי מרקמות בעלי חיים שונות.

ספקטרופוטומטר:

הספקטרופוטומטר משמש בעיקר לקביעת הריכוז והטוהר של ה-RNA, אך הוא אינו יכול לזהות את שלמות ה-RNA והשאריות הגנומיות.ביניהם, A260/280 ו-A260/230 הם פרמטרים חשובים לזיהוי טוהר ה-RNA, וניתן לזהות את טוהר ה-RNA בהתאם לתנודת הערכים שלהם:

1. 1.9< A260/280< 2.1, המצביע על כך שטוהר ה-RNA טוב;A260/280<1.9, המצביע על כך שייתכן שיש שאריות חלבון ב-RNA;A260/280>2.1, המצביע על פירוק חלקי אפשרי של RNA, אשר ניתן לאשר עוד יותר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, המצביע על כך שטוהר ה-RNA טוב;A260/230<2.0, המצביע על כך שייתכנו שאריות של ריאגנטים אורגניים ב-RNA, כגון פנולים, אתנול או סוכרים.

אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז:

בדיקת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז יכולה לנתח את שלמות ה-RNA, שאריות הגנום והחלבון, אך אינה יכולה לכמת במדויק את ריכוז ה-RNA או לזהות שאריות של ריאגנטים אורגניים.קח לדוגמא תבניות RNA אוקריוטיות:

1. ה-RNA היה נתון לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.אם היו רק שלוש רצועות בודדות של 28sRNA, 18sRNA ו-5.8sRNA במפת הג'ל, זה מצביע על כך שה-RNA המופק שלם.אם יש תופעת גרירה, זה מצביע על פירוק חלקי של RNA.

2. אם יש פס בהיר בודד בין חור הדבק לרצועת 28sRNA, ייתכן שיש שאריות DNA גנומי.

3. אם מופיעות פסים בחור הדבק, זה מצביע על כך שייתכנו שאריות של חלבון וחומרים מקרומולקולריים אחרים.

Ⅱ. תמלול הפוך

לאחר סיום מיצוי ה-RNA, יש להפוך אותו ל-cDNA לניסויים הבאים, כך ששלב ההיפוך חיוני.שעתוק הפוך יוצג מתוך הבחירה של תעתיק הפוך ופריימר:

בחירת תמלול הפוך:

התעתיקים ההפוכים האופייניים כוללים AMV RTase ו-MMLV RTase.ל-RNase H של AMV RTase יש פעילות חזקה, אורך סינתזה קצר, כמות סינתזה נמוכה ויציבות תרמית טובה (42 ~ 55℃).פעילות RNase H של MMLV RTase חלשה, אורך הסינתזה ארוך, כמות הסינתזה גבוהה והיציבות התרמית ירודה (37 ~ 42℃).

מכיוון שלאנזים RNase H יש את הפונקציה של פירוק תבנית RNA, יש לבחור MMLV עם פעילות RNase H חלשה במהלך שעתוק הפוך, ולאחר הנדסה גנטית מאוחרת יותר, היציבות התרמית של MMLV הגיעה לזינוק איכותי.לוקח את ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV לתעתוק הפוך) כדוגמה, מדובר ב-reverse transcriptase חדש המתבטא בחיידקים מהונדסים של E. coli באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה גנטית.זהו פולימראז DNA רקומביננטי המסנתז גדיל DNA משלים מ-RNA חד-גדילי, DNA או היברידית RNA:DNA.אין לו פעילות RNase H, יציבות חזקה, זיקה חזקה ל-RNA ורגישות זיהוי גבוהה.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV לתעתוק הפוך)

בחירת פריימר:

בדרך כלל פריימרים RT מתחלקים לשלוש קטגוריות: אוליגו dT, פריימרים אקראיים ופריימרים ספציפיים לגנים.בחר פריימרים מתאימים לשימוש על פי דרישות ניסיוניות שונות.

1. אם התבנית היא ממקור אוקריוטי וה-cDNA המאוחר משמש להגברת PCR שגרתית, מומלץ אוליגו (dT);אם הניסוי שלאחר מכן משמש רק עבור qPCR, מומלץ לערבב את Oligo (dT) עם פריימרים אקראיים כדי לשפר את היעילות של שעתוק הפוך.

2. אם התבנית היא מפרוקריוטים, יש לבחור פריימרים אקראיים או פריימרים ספציפיים לגנים עבור שעתוק הפוך.

Ⅲ.qPCR

כימות הקרינה נבנה בעיקר מבחירת שיטות כמותיות, עקרונות עיצוב פריימר, בחירת ROX, תצורת מערכת תגובה והגדרת תנאי תגובה וכו'.

מבחר שיטות כמותיות:

שיטות כמותיות מחולקות לשיטות כמותיות יחסיות ושיטות כמותיות מוחלטות.ניתן להשתמש בכימות יחסי כדי לזהות את ההשפעה של שיטות טיפול מסוימות על ביטוי גנים, לזהות את ההבדל בביטוי הגנים בזמנים שונים ולהשוות את ההבדל בביטוי הגנים ברקמות שונות.כימות מוחלט יכול לזהות את כמות חומצת הגרעין בנגיף וכן הלאה.בעת ביצוע ניסויים, עלינו לבחור את השיטות הכמותיות המתאימות בהתאם לניסויים שלנו.

עקרונות עיצוב פריימר:

עיצוב הפריימר עבור qPCR קשור ישירות ליעילות ההגברה ולספציפיות המוצר.לכן, תכנון נכון של פריימרים טובים הוא השלב הראשון של qPCR מוצלח.בתכנון של פריימר, יש לשים לב לעקרונות הבאים כאשר עומדים בעקרון של עיצוב פריימר קונבנציונלי:

1. אורך שבר המטרה נשלט בין 100 ל-300 bp;

2. עיצוב חוצה אקסון כדי למנוע את ההשפעה של DNA גנומי;

3. יש לבדוק את יעילות ההגברה של הפריימרים המעוצבים, ורק כאשר יעילות ההגברה מגיעה לתקן (90-110%) ניתן להשתמש בהם לניסויים כמותיים;

4. ריכוז פריימר מותאם בדרך כלל בין 0.1uM ל-1.0uM.

מבחר שלרוקס:

בתהליך של תגובה כמותית, ROX יכול להתאים את הפרש הנתיב האופטי, שגיאת פיפטציה או הפרש נפח הנגרמים על ידי אידוי ועיבוי באופן אחיד, ולשפר את יכולת החזרה של התוצאות.עם זאת, יש לציין שהבחירה של ROX קשורה למכשיר.אם למכשיר qPCR יש את הפונקציה של תיקון אוטומטי של ההבדל בין חורים, אין צורך להוסיף ROX;אחרת, עליו להוסיף תיקון ROX.שותפים קטנים בקניית ריאגנטים חייבים להיות בהתאם למכשיר המשמש לבחירת ה-ROX הנכון, הימנע מטעויות מאוחרות יותר.

הכנת מערכת תגובה:

נפחי תגובה של 20ul ו-50ul עדיפים.יש לשים לב לעניינים הבאים בעת גיבוש המערכת:

1. יש להכין את מערכת התגובה על ידי אוורור בשולחן העבודה האולטרה נקי, ddH חדש₂O משמש עבור כל ניסוי;

2. כל ניסוי צריך להכין NTC כדי לוודא אם יש זיהום במערכת, וכל זוג פריימרים צריך לעשות NTC בעת הכנת המערכת;

3. כדי לזהות אם יש שאריות gDNA בתבנית ה-RNA, ניתן להכין NRT עבור כל דגימה לגילוי;

4. בהכנת המערכת, מומלץ לבצע לפחות 3 חזרות טכניות לדגימה אחת;

5. כאשר התבנית היא cDNA, מומלץ לדלל 5-10 פעמים כדי להפחית את השפעת העיכוב של מערכת שעתוק לאחור בניסוי qPCR.עדיף לחקור את כמות התבנית לפי שיפוע, כך שערך ה-CT יפול בין 20-30;

6. קבע את מספר התגובות הנדרש, הגדל ב-5-10% על בסיס מספר התגובות וחשב את מספר תצורת הנפח;

7, המערכת מוכנה באמצעות עקרון ה-premix, ערבוב לאחר צנטריפוגה ומבטיח ללא בועות;

8, עד כמה שניתן לבחור חומרים מתכלים תומכים.

ערכת RT-qPCR קשורה