כולם מדברים על העיקרון של ניסוי qRT-PCR, תכנון פריימר, פרשנות של תוצאות וכו', אבל אני חושב שכדאי לי לשתף אתכם בפעולה הניסיונית של qRT-PCR.זה קטן, אבל זה קשור לתוצאות.

לפני ביצוע qRT-PCR, עלינו להיות בעלי הבנה ברורה של RNA ושיטות הפעולה שלנו.אחרי הכל, המאמצים שלנו מכוונים להשיג תוצאות, במקום פשוט להתאמן.אז לפני ביצוע qRT-PCR, עלינו לקבוע את הבעיות הבאות (שחלקן חלות רק על SYBR).

1 האם אתה בטוח שה-RNA שלך לא מושפל?

NanoDrop 2000 יכול לזהות רק את הריכוז והטוהר של ה-RNA, אך אינו יכול לזהות את שלמות ה-RNA.

ערך ה-RNA (מספר אינטנסיביות של RNA) יכול לשקף את שלמות ה-RNA, אשר מזוהה על ידי מערכת Agilent 2100 Bioanalyzer.

איור. תרשים סכמטי של ערכי RIN עבור דגימות RNA שונות (אוקריוטים)

עם זאת, בדרך כלל אין במעבדות את Agilent 2100 Bioanalyzer.במקרה זה, אנו יכולים לזהות באמצעות ג'ל פורמלדהיד, אך הדרישה לכמות הכוללת של RNA גבוהה, ולכן השיטה המהירה ביותר היא להשתמש באלקטרופורזה ג'ל רגילה.זה נדרש להיות בסביבה נטולת נוקלאז, ולכן יש צורך לשטוף את מיכל האלקטרופורזה, בקבוק הסול, תושבת הג'ל והמסרק עם מי DEPC.האגרוז גם נטול נוקלאז (כל עוד הוא נפתח טרי), ואת מאגר ה-Loading יש לפתוח טרי כמה שאפשר, עם 1.2% ג'ל.

שימו לב שהג'ל חייב להיות מומס לחלוטין, אחרת הוא יגרום להקות לא הומוגניות, כפי שמוצג בדוגמה 9 באיור.אם המתח גבוה מדי או פועל במשך זמן רב מדי יגרום חום ויגרום לפירוק RNA, ולכן יש לשלוט במתח ובזמן בצורה סבירה.בנוסף, ריצת ג'ל יכולה גם לקבוע אם יש שאריות DNA בדגימה, ולבחון אם יש מספר רב של פסים שנשמרו בבאר המחלקה.

דמות.גילוי אלקטרופורזה בג'ל של RNA

2 האם אתה בטוח לגבי ריכוז ה-cDNA שלך?

הניסיון של האחים הגדולים במעבדה הוא שה-cDNA של מערכת 20 ul המתקבלת בכל היפוך מדולל ישירות פי 20, בעוד שהאחיות הפוסט-דוקטורטות מדוללות פי 10.אני בדרך כלל תלוי במצב.מכיוון שאיכות ה-RNA שמוזכר על ידי כל אדם שונה, גם רמת ההיפוך שונה, ויתכן וטכנולוגיית ההיפוך לא תהיה יציבה.

אז בכל פעם שאני מקבל את ה-cDNA ההפוך, אני אדלל אותו תחילה בערך 3 פעמים, ואז אשתמש בגן ​​משק הבית כדי לעשות RT-PCR, מספר המחזורים הוא בדרך כלל 25 מחזורים, כדי לזהות את הריכוז הספציפי, ולאחר מכן לקבוע את גורם הדילול הסופי.

3 האם אתה בטוח שהפריימרים שלך קלים לשימוש?

זה יכול לעבור את עקומת ההיתוך של qRT-PCR, אבל זה עדיין עולה כסף.עבור מעבדות ללא הרבה כסף, כאשר הם מקבלים הרבה פריימרים, הם יכולים להשתמש ב-RT-PCR רגיל כדי לראות אם מדובר בפס בודד ולזהות את הספציפיות של הפריימרים.אם למעבדה לא חסר כסף, ניתן לזהות את הספציפיות של כל הפריימרים פעם אחת דרך עקומת ההיתוך.

4 האם אתה בטוח שתנאי הניסוי שלך מתאימים?

יש להגן על SYBR מאור חזק, אז נסה לכבות את האור העילי בעת הוספת ריאגנט SYBR, ורק צריך להשתמש באור עמום כדי להשלים אותו.

אחסן את SYBR ב-4 מעלות צלזיוס.בעת השימוש, הפוך בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב כדי למנוע קצף, ואל תערבב במרץ.

כמה אחיות צעירות יותר אוהבות לצייר סימנים על לוח ה-PCR מחשש לערבב את הדגימות, וזה שגוי.מכיוון שהסמנים שלך צפויים מאוד להשפיע על אוסף האותות הפלורסנטים, אני בדרך כלל ממליץ לצעירים להשתמש במחברות ניסיוניות כדי לסייע בזיכרון, כפי שמוצג להלן.

דמות.דיאגרמת טעינת מדגם qRT-PCR

5 האם אתה בטוח שאתה עושה את זה נכון?

הקפידו ללבוש כפפות, ללבוש כפפות, ללבוש כפפות, ולומר דברים חשובים שלוש פעמים.

על מנת לצמצם את החשיפה של SYBR לאור, אני אישית אוהב להוסיף תחילה תבנית, כפי שמוצג באיור למטה.על פי הניסיון, תוספת של כמות קטנה של תבנית עשויה לגרום לשגיאות דגימה.לכן, על מנת למזער את השגיאה הנגרמת על ידי הוספת כמות קטנה של תבנית, אני בדרך כלל מכפיל את הדגימה שוב, ומכפיל את הכמות בעת הוספת הדגימה כדי להפחית את כמות ה-H2O2 הנוספת.

דמות.תרשים סכמטי של טעינת qRT-PCR

לאחר מכן הגדר את מערכת qRT-PCR באופן הבא.

דמות.תרשים הכנת מערכת qRT-PCR

הערה: תהליך ההגדרה צריך להיעשות על קרח.

לאחר הוספת המדגם, הדבק את סרט האיטום השקוף.השתדלו לא לגעת בידיים במשטח של סרט האיטום השקוף, פשוט הפעל מהחלל משני צידי הסרט.מכיוון שטביעות אצבע עשויות להשפיע גם על איסוף אותות ניאון.לאחר מכן השתמש בצנטריפוגה כדי לצנטרל במהירות במשך 10 שניות במהירות נמוכה כדי למנוע מהדגימה להיתלות על הקיר.

מוצרים קשורים:

ערכת Cell Direct RT-qPCR

RT Easy II