RT-qPCR הוא הניסוי הבסיסי של הביולוגיה המולקולרית, וכולם חייבים להכיר אותו.זה כולל בעיקר שלושה שלבים: מיצוי RNA, שעתוק הפוך ל-cDNA ו-PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת.זה לא עוזר, מה קורה?סביר להניח שיש בעיה עםניסוי התעתיק ההפוך!למרות שנראה שניסוי השעתוק ההפוך צריך רק להוסיף RNA, dNTP, פריימרים ו-תמלול הפוךלצינור הצנטריפוגה ומערבבים היטב, אבל בתהליך הפעולה בפועל, עדיין יש הרבה פרטים שצריך לשים אליהם לב.בואו ללמוד על זה!

כיצד לשפוט את איכות ה-RNA?
כדי להשיג cDNA, איכות ה-RNA היא קריטית!ניתן לזהות את איכות ה-RNA בעיקר משני היבטים:
(1) שלמות RNA:ניתן לאמת את שלמות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. אם לוקחים איקריוטים כדוגמה, ל-RNA הכולל השלם יש שלוש פסים ברורים, המשקלים המולקולריים מגדול לקטן הם 28S, 18S ו-5S, ו-28S בהיר פי שניים מ-18S;אם ניתן לראות שלוש פסים, אבל סוג הלהקה מטושטש או דיפוזיה פירושו שה-RNA מושפל חלקית.בשלב זה, אנא בצע את תגובת השעתוק ההפוכה באופן מיידי והגדל את קלט התבנית כראוי;אם ניתן לראות רק פס עם משקל מולקולרי קטן או ללא פס, ה-RNA הושפל לחלוטין ויש לחלץ אותו מחדש.Agilent 2100 מציין את שלמות ה-RNA עם דיאגרמת שיא וערך RIN.אם חומצת הגרעין שלמה, קו הבסיס של האלקטרופרוגרמה שטוח;אם חומצת הגרעין מושפלת בצורה חמורה, קו הבסיס אינו אחיד ומופיעים יותר שיאי פירוק;הערך של RIN משקף את שלמות ה-RNA, בטווח של 0-10, ככל שהערך גדול יותר, כך איכות ה-RNA טובה יותר.ובכן, ככל שדרגת השלמות גבוהה יותר.
(2) טוהר ה-RNA:ניתן לזהות את היחס בין OD260/280 באמצעות ספקטרופוטומטריית UV.אם היחס בין OD260/280 הוא בין 1.9 ל-2.1, הטוהר טוב מאוד.
שיורי DNA גנומי עלול להוביל לתוצאות כמותיות לא מדויקות
כאשר RNA מופק, ה-RNA שאנו מקבלים עשוי להיות מעורבב עם DNA גנומי (gDNA) שלא נוקה.לכן, ה-cDNA לאחר שעתוק הפוך יתערבב גם עםgDNA.במהלך המורד הזרםqPCRתְגוּבָה,cDNAו-gDNA עשוי להיות מוגבר בו-זמנית, וכתוצאה מכך ערך CT קטן יחסית, כך שהתוצאות עשויות להיות מוטות.
אז מה עלינו לעשות במצב הזה?פורג'יןמציע:
(1) בצע ניקוי גנום על ה-RNA ההפוך, אותו ניתן להסיר על ידי מיצוי עמודה במהלך מיצוי RNA;
(2) טפל ב-RNA המופק עם DNaseI , אבל לסיים אותו עם EDTA;
של ריאגנטים לשעתוק הפוךעם מודולים לניקוי גנום;

איך בוחרים פריימרים לשעתוק הפוך?
פריימרים לשעתוק הפוך משפיעים גם על התוצאה של תגובת השעתוק ההפוכה.אתה יכול לבחור פריימרים אקראיים, Oligo dT או פריימרים ספציפיים לגנים עבור שעתוק הפוך בהתאם לנסיבות הספציפיות של הניסוי:
(1) תמלילים ספציפיים: פריימרים ספציפיים לגנים מומלצים;
(2) תמלול קטעים ארוכים: פריימרים ספציפיים ל-Oligo dT/גנים מומלצים;
(3) קטעים פנימיים של תמלילים מקטעים ארוכים: פריימרים ספציפיים לגנים/ פריימרים אקראיים / פריימרים אקראיים + Oligo dT.אם מבצעים את ניסוי ה-qPCR שלאחר מכן, לא ניתן להשתמש ב-Oligo dT לבדו, מכיוון ששימוש ב-Oligo dT לבדו עלול לגרום להטיית קצה 3', מה שיוביל לתוצאות לא מדויקות של ניסוי qPCR;
(4) מירנה: ניתן להשתמש בפריימרים של לולאת גזע או פריימר זנב.

כמה פעמים צריך לדלל את תוצר השעתוק האחורי cDNA לצורך כימות?
לאחר קבלת ה-cDNA של תוצר השעתוק ההפוך, חשוב מאוד כמה פעמים יש לדלל את ה-cDNA עבור ניסויי qPCR.אם ריכוז ה-cDNA גבוה מדי או נמוך מדי, יעילות ההגברה עלולה להיפגע.האם ניתן למדוד את ריכוז ה-cDNA, וכיצד יש לעשות זאת?
(1) לא ניתן למדוד את ריכוז ה-cDNA של תוצר השעתוק האחורי, מכיוון שבנוסף לתוצר ה-cDNA, תוצר השעתוק ההיפוך מכיל גם שאריות של תמלול הפוך, Buffer, transcriptase הפוכה, פריימרים וכו', אשר יפריעו לתוצאות מדידת הריכוז ויגרום ל-OD260/280, OD260/260 לא משקף יחס לא נורמלי ולפיכך OD30iel לא תקין.בזמן הזה, יאמרו כמה חברים, אז אני אמדוד את הריכוז לאחר הטיהור;כאן, Foregene רוצה להזכיר שלא מומלץ לטהר את ה-cDNA, מכיוון שאורך ה-cDNA המתקבל על ידי ההיפוך שונה, וה-cDNA הקצר יאבד בטיהור.
(2) אז מה לעשות?לפני ניסוי ה-qPCR, ניתן לקבוע את שיפוע הדילול של ה-cDNA באמצעות הניסוי המקדים.לדוגמה: השתמש בתמיסת מניות cDNA, בדילול פי 10 ובדילול פי 100 כתבניות לניסויי qPCR, ובחר את מקדם הדילול עם ערך CT בטווח של 18-28.

כיצד יש לתמלל miRNA לאחור?
miRNA הוא RNA מולקולה קטנה חד-גדילית בגודל של כ-22 nt שאינו מקודד לחלבון.בגלל אורכה הקצר, שיטת qPCR קונבנציונלית קשה לכמת אותה ישירות, ולכן לעתים קרובות יש צורך להרחיב את ה-miRNA;שיטות השעתוק ההפוכות הנפוצות עבור miRNA כוללות שיטת לולאת גזע ושיטת זנב.
שיטת לולאת הגזע היא להרחיב את ה-miRNA על ידי הוספת פריימרים לולאת גזע.לשיטת זיהוי זו יש רגישות וסגוליות גבוהות יותר, אך תפוקת הזיהוי נמוכה.שעתוק הפוך אחד יכול לזהות רק מירנה אחד והתייחסות פנימית;שיטת הוספת הזנב מורכבת משניים. היא הושלמה על ידי פעולה משותפת של שני אנזימים, שהם PolyA פולימראז ו-Reverse Transcriptase.PolyA פולימראז אחראי על הוספת זנבות PolyA ל-miRNA כדי להגדיל את אורכו, ותעתיק הפוך מבצע תגובת שעתוק הפוכה.לשיטה זו יש תפוקת זיהוי גבוהה והיא יכולה לזהות מספר מירנאים והתייחסויות פנימיות בשעתוק הפוך אחד, אך הרגישות והספציפיות נמוכות בשיטת סטם-לולאה.