בניסויי qPCR, עיצוב פריימר הוא גם קישור חשוב מאוד.האם הפריימרים מתאימים או לא קשורה קשר הדוק לשאלה האם יעילות ההגברה מגיעה לסטנדרט, האם המוצרים המוגברים הם ספציפיים והאם תוצאות הניסוי זמינות.
אז איך להפוך את הספציפיות של פריימר qPCR טוב יותר?יעילות הגברה גבוהה?
היום, ניקח אותך לעצב יחד פריימרים של qPCR, וניתן לעיצוב פריימר qPCR להפוך למיומנות ידע יעילה בניסויים.
בעת תכנון פריימרים של qPCR, בדרך כלל יש לשים לב לנקודות הבאות: יש לתכנן פריימרים על פני אינטרונים ככל האפשר, אורך המוצר צריך להיות 100-300 bp, ערך Tm צריך להיות קרוב ככל האפשר ל-60°C, והפריימרים במעלה הזרם והמורד צריכים להיות קרובים ככל האפשר, וסוף הפריימר צריך להיות G C, וכו'.
1. עיצוב פריימרים המתפרשים על אינטרונים
בעת תכנון פריימרים של qPCR, בחירת פריימרים המעוצבים על פני אינטרונים יכולה למנוע את הגברה של תבנית ה-gDNA, והתוצרים כולם נגזרים מההגברה של cDNA, ובכך לבטל את השפעת זיהום ה-gDNA.
2. אורך פריימר
אורך הפריימר הוא בדרך כלל בין 18-30 nt, ויש לשלוט על אורך תוצר ההגברה בין 100-300 bp ככל האפשר.
אם הפריימר קצר מדי, הוא יוביל להגברה לא ספציפית, ואם הוא ארוך מדי, הוא יוצר בקלות מבנה משני (כגון מבנה סיכת ראש).אם תוצר ההגברה ארוך מדי, הוא אינו מתאים לתגובה של פולימראז, מה שישפיע על יעילות הגברה של PCR.
3. תוכן GC וערך Tm
יש לשלוט על תכולת GC של פריימרים בין 40% ל-60%.אם זה גבוה מדי או נמוך מדי, זה לא תורם לתחילת התגובה.תכולת ה-GC של הפריימרים קדימה ואחורה צריכה להיות קרובה לאותו על מנת להשיג את אותו ערך Tm וטמפרטורת חישול.
ערך ה-Tm צריך להיות בין 55-65 מעלות צלזיוס ככל האפשר, בדרך כלל סביב 60 מעלות צלזיוס, וערך ה-Tm של הזרם והמורד צריך להיות קרוב ככל האפשר, רצוי לא יותר מ-4 מעלות צלזיוס.
4. הימנע מבחירה ב-A בקצה 3′ של הפריימר
כאשר קצה 3′ של הפריימר אינו תואם, ישנם הבדלים גדולים ביעילות הסינתזה של בסיסים שונים.כאשר הבסיס האחרון הוא A, הוא יכול גם ליזום סינתזת שרשרת אפילו במקרה של חוסר התאמה, וכאשר הבסיס האחרון הוא T When, יעילות השראת חוסר ההתאמה מופחתת מאוד.לכן, השתדלו להימנע מבחירה ב-A בקצה 3′ של הפריימר, ועדיף לבחור ב-T.
אם מדובר בפריימר בדיקה, קצה ה-5' של הבדיקה לא יכול להיות G, מכיוון שגם כאשר בסיס G בודד מחובר לקבוצת הדיווח הפלורסנטי של FAM, G יכול גם לכבות את אות הפלורסנט הנפלט על ידי קבוצת FAM, וכתוצאה מכך תוצאות שליליות שגויות.לְהוֹפִיעַ.
5. התפלגות בסיס
ההתפלגות של ארבעת הבסיסים בפריימר היא רצוי אקראית, הימנעות יותר מ-3 G או C עוקבים בקצה ה-3', ויותר מ-3 עוקבים.קל ליצור זיווג G או C באזור הרצף העשיר ב-GC.
6. אזור עיצוב הפריימר צריך להימנע ממבנים משניים מורכבים.
המבנה המשני שנוצר על ידי הגדיל הבודד של תוצר ההגברה ישפיע על התקדמות חלקה של PCR.על ידי חיזוי מראש אם יש מבנה משני ברצף המטרה, נסו להימנע מאזור זה בתכנון של פריימרים.
7. הפריימרים עצמם ובין הפריימרים צריכים לנסות להימנע מבסיסים משלימים עוקבים.
לא יכולה להיות השלמה רצופה של 4 בסיסים בין הפריימר עצמו לפריימר.הפריימר עצמו לא אמור להיות בעל רצף משלים, אחרת הוא יקפל את עצמו ליצירת מבנה סיכת ראש, מה שישפיע על שילוב החישול של הפריימר והתבנית.
רצפים משלימים אינם יכולים להתקיים בין פריימרים במעלה הזרם למורד הזרם.השלמה בין פריימרים תייצר דימרי פריימר, שיפחיתו את יעילות ה-PCR ואף ישפיעו על הדיוק הכמותי.אם מבני הפריימר-דימר וסיכת השיער הם בלתי נמנעים, ערך △G לא צריך להיות גבוה מדי (צריך להיות פחות מ-4.5 קק"ל/מול).
8. הפריימרים מגבירים את המוצר הספציפי למטרה.
המטרה הסופית של זיהוי qPCR היא להבין את השפע של גן המטרה.אם מתרחשת הגברה לא ספציפית, הכימות יהיה לא מדויק.לכן, לאחר עיצוב הפריימרים, הם צריכים להיבדק על ידי BLAST, ולהשוות את הספציפיות של המוצרים במסד הנתונים של הרצף.
לאחר מכן, ניקח את הגן האנושי GAS6 (Growth stop specific 6) כדוגמה לעיצוב פריימרים של qPCR.
גן שאילתה 01
הומו GAS6דרך NCBI.כאן, עלינו לשים לב להשוואת שם הגן והמינים כדי להבטיח שהם עקביים.
02 מצא את רצף הגנים
(1) אם רצף המטרה הוא DNA גנומי, בחר את הראשון, שהוא רצף ה-DNA הגנומי של הגן.
(2) אם רצף המטרה הוא mRNA, בחר את השני.לאחר הכניסה, לחץ על "CDS" בטבלה למטה.רצף הרקע החום הוא רצף הקידוד של הגן.
03 פריימרים עיצוביים
היכנס לממשק Primer-BLAST
הזינו את מספר רצף הגנים או הרצף בפורמט Fasta בצד שמאל למעלה, ומלאו את הפרמטרים הרלוונטיים.

לחץ על "קבל פריימרים" ו-NCBI יופיע כדי לומר לך שבחירת פרמטרים כזו תוגבר לגרסאות שחבור אחרות.נוכל לבדוק את גרסאות השחבור השונות ולהגיש אותן כדי לקבל את זוג הפריימר המתאים (כפי שמוצג באיור למטה).תהליך זה עשוי להימשך עשרות שניות.
טמפרטורות החישול של זוגות הפריימרים הללו הן כולן סביב 60 מעלות צלזיוס.לפי מטרת הניסוי יש לבחור פריימרים באורך בינוני, ספציפיות טובה ופחות השלמה עצמית של הפריימרים לניסוי ואחוזי ההצלחה די גבוהים!
04 אימות ספציפיות של פריימר
למעשה, בנוסף לעיצוב פריימרים, Primer-Blast יכולה להעריך גם את הפריימרים שעיצבנו בעצמנו.חזרו לדף עיצוב הפריימר, הזינו את הפריימרים במעלה הזרם והמורד שתכננו, ופרמטרים אחרים לא יותאמו.לאחר ההגשה, ניתן לראות האם צמד הפריימרים קיים גם על גנים אחרים.אם כולם מוצגים על הגן שאנו רוצים להגביר, מה שמצביע על כך שהספציפיות של זוג הפריימרים הזה היא גדולה!(לדוגמה, זו התוצאה היחידה של שאילתת ה-primer!)

05 שיפוט איכות פריימר
איזה סוג פריימר הוא הפריימר ה"מושלם" המשלב "יעילות הגברה עד תקן", "מאפייני מוצר מוגברים" ו"תוצאות ניסוי אמינות"?
יעילות הגברה

עקומת התכה
יעילות ההגברה של הפריימרים מגיעה ל-90%-110%, כלומר יעילות ההגברה טובה, ולעקומת ההיתוך יש שיא בודד ובדרך כלל Tm>80°C, מה שאומר שסגוליות ההגברה טובה.
 
מוצרים קשורים:
זמן אמת PCR Easy–SYBR GREEN I
זמן אמת PCR Easy-Taqman