Fluorescence quantitative PCR (הידוע גם בשם TaqMan PCR, להלן FQ-PCR) היא טכנולוגיה כמותית חדשה של חומצות גרעין שפותחה על ידי PE (Perkin Elmer) בארצות הברית בשנת 1995. טכנולוגיה זו מבוססת על PCR קונבנציונלי על ידי הוספת בדיקות עם תווית פלורסנט.בהשוואה ל-PCR גמיש, ל-FQ-PCR יתרונות רבים למימוש הפונקציה הכמותית שלו.מאמר זה מתכוון לתאר בקצרה את המאפיינים, העקרונות, השיטות והיישומים של הטכנולוגיה.

1 תכונות

ל-FQ-PCR יש לא רק את הרגישות הגבוהה של PCR רגיל, אלא גם בגלל היישום של בדיקות ניאון, הוא יכול לזהות ישירות את השינוי של האות הפלואורסצנטי במהלך הגברה של PCR דרך מערכת ההולכה הפוטואלקטרית כדי להשיג תוצאות כמותיות, שמתגברות על חסרונות רבים של PCR קונבנציונלי, ולכן יש לו גם דיוק גבוה של טכנולוגיית ה-DNA ההיברידית והספציפיות הגבוהה של טכנולוגיית ה-DNA.

לדוגמה, יש צורך לצפות במוצרי PCR כלליים על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז וצביעת אתידיום ברומיד באור אולטרה סגול או על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד וצביעת כסף.זה לא רק דורש מספר מכשירים, אלא גם לוקח זמן ומאמץ.הכתמים בהם נעשה שימוש באתידיום ברומיד מזיקים לגוף האדם, והליכי ניסוי מסובכים אלו מספקים הזדמנויות לזיהום ותוצאות חיוביות כוזבות.עם זאת, FQ-PCR צריך לפתוח את המכסה רק פעם אחת במהלך טעינת הדגימה, והתהליך שלאחר מכן הוא פעולת שפופרת סגורה לחלוטין, שאינה דורשת עיבוד PCR לאחר, תוך הימנעות מחסרונות רבים בפעולות PCR קונבנציונליות.הניסוי משתמש בדרך כלל במחזור התרמי ABI7100 PCR שפותח על ידי חברת PE.

למכשיר יש את המאפיינים הבאים: ① יישום רחב: ניתן להשתמש בו לכימות מוצרי PCR של DNA ו-RNA, מחקר ביטוי גנים, זיהוי פתוגנים ואופטימיזציה של תנאי PCR.② עיקרון כמותי ייחודי: באמצעות בדיקות עם תיוג פלואורסצנטי, כמות הקרינה תצטבר עם מחזור ה-PCR לאחר עירור בלייזר, כדי להשיג את מטרת הכימות.③ יעילות עבודה גבוהה: מחזור תרמי 9600 PCR מובנה, מבוקר מחשב 1 עד 2 שעות כדי להשלים את ההגברה והכימות של 96 דגימות באופן אוטומטי וסינכרוני.④ אין צורך באלקטרופורזה של ג'ל: אין צורך לדלל ולאלקטרופורזה את הדגימה, פשוט השתמש בבדיקה מיוחדת כדי לזהות ישירות בצינור התגובה.⑤אין זיהום בצנרת: צינור התגובה הייחודי הסגור במלואו ומערכת ההולכה הפוטואלקטרית מאומצים, כך שאין צורך לדאוג לזיהום.⑥התוצאות ניתנות לשחזור: הטווח הדינמי הכמותי הוא עד חמישה סדרי גודל.לכן, מאז שטכנולוגיה זו פותחה בהצלחה, היא זכתה להערכה על ידי חוקרים מדעיים רבים ויושמה בתחומים רבים.

2 עקרונות ושיטות

עקרון העבודה של FQ-PCR הוא להשתמש בפעילות האקסונוקלאז 5′→3′ של אנזים Taq כדי להוסיף בדיקה מסומנת פלואורסצנטית למערכת התגובה PCR.הבדיקה יכולה לבצע הכלאה ספציפית עם תבנית ה-DNA הכלולה ברצף ה-primer.קצה ה-5 של הגשושית מסומן בגן פליטת הקרינה FAM (6-carboxyfluorescein, שיא פליטת פלואורסצנטי ב-518nm), וקצה ה-3 מסומן ב-The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylpeakrhodamine 58nm fluorescence), גזירת הבדיקה עוברת פוספורילציה כדי למנוע את הארכת הבדיקה במהלך הגברה של PCR.כאשר הבדיקה נשארת שלמה, קבוצת המרווה מדכאת את פליטת הקרינה של הקבוצה הפולטת.ברגע שהקבוצה הפולטת מופרדת מקבוצת ה-Quenching, העיכוב מורם, והצפיפות האופטית ב-518nm עולה ומתגלה על ידי מערכת זיהוי הקרינה. בשלב ה-renaturation, הגשש כלאיים עם ה-DNA של התבנית, והאנזים Taq בשלב ההארכה נע לאורך תבנית ה-DNA עם הרחבה של ה-DNA.כאשר הגשושית מנותקת, אפקט המרווה משתחרר והאות הפלורסנטי משתחרר.בכל פעם שהתבנית מועתקת, חותכים בדיקה, מלווה בשחרור אות ניאון.מכיוון שקיים קשר אחד לאחד בין מספר הפלואורופורים המשוחררים למספר מוצרי PCR, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לכמת במדויק את התבנית.מכשיר הניסוי משתמש בדרך כלל במחזור התרמי ABI7100 PCR שפותח על ידי חברת PE, וניתן להשתמש גם במחזורים תרמיים אחרים.אם נעשה שימוש במערכת תגובה מסוג ABI7700 לניסוי, לאחר השלמת התגובה, ניתן לתת את התוצאות הכמותיות ישירות באמצעות ניתוח מחשב.אם אתה משתמש במחזורים תרמיים אחרים, עליך להשתמש בגלאי הקרינה כדי למדוד את אות הקרינה בצינור התגובה בו זמנית כדי לחשב RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ מייצג את היחס בין עוצמת הזוהר של קבוצת פליטת הפלורסנט של צינור הדגימה לעוצמת הארה של קבוצת ההמרה, RQ- מייצג את היחס בין השניים בצינור הריק, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) מייצג את כמות התוצאות של שינוי האותות במהלך הקרינה, לאחר תהליך הקרינה שניתן להשיג לאחר תוצאות הקרינה.עקב הכנסת בדיקות פלורסנט, הספציפיות של הניסוי משתפרת באופן משמעותי.תכנון הבדיקה צריך לעמוד בדרך כלל בתנאים הבאים: ①אורך הבדיקה צריך להיות בערך 20-40 בסיסים כדי להבטיח את הספציפיות של הקישור.②התוכן של בסיסי GC הוא בין 40% ל-60% כדי למנוע כפילות של רצפי נוקלאוטידים בודדים.③ הימנע מהכלאה או חפיפה עם פריימרים.④ יציבות הקישור בין הפרוב לתבנית גדולה יותר מיציבות הקישור בין הפריימר לתבנית, ולכן ערך ה-Tm של הפרוב צריך להיות לפחות ב-5°C גבוה מערך ה-Tm של הפריימר.בנוסף, לריכוז הבדיקה, ההומולוגיה בין הבדיקה לרצף התבנית, והמרחק בין הבדיקה לפריימר, כולם משפיעים על תוצאות הניסוי.

מוצרים קשורים:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(עם gDNase)(Super Premix לסינתזת cDNA של גדיל ראשון מ-lncRNA) יצרן וספק |Foregene (foreivd.com)

סין זמן אמת PCR Easyᵀᴹ-Taqman יצרן וספק |Foregene (foreivd.com)