RNase היא מילה רגישה שסטודנטים רבים שלעתים קרובות עורכים ניסויי מיצוי RNA לא רוצים לשמוע.חמוש במלואו, ה-RNA שהוצא לבסוף עם הריאגנטים הרעילים ביותר פנול וכלורופורם התפרק.אני לא שלמה!!!היום, בואו נסתכל על מקורו של הרנאס המפורסם.

ריבונוקלאז (RNase), או RNase, הוא נוקלאז שיכול לבצע הידרוליזה של RNA למולקולות קטנות.RNase, כחלבון מולקולה קטנה, יציב בצורה יוצאת דופן .עיקור קיטור ומעכבי חלבון רגילים בטמפרטורה גבוהה ובלחץ גבוה אינם יכולים להשבית אותו לחלוטין.היציבות של RNase מגיעה בעיקר מהקשרים הדיסולפידיים במבנה.לדוגמה, ה-RNase הנפוץ של לבלב בקר מכיל רק 124 חומצות אמינו, אך מכיל 4 קשרים דיסולפידים.קשר גופרית וקשר דיסולפיד מעניקים ל-RNase יציבות תרמית מעולה.בנוסף, ל-rnase משקל מולקולרי קטן יחסית והוא יכול לשחזר במהירות את המבנה המקורי שלו במקרים רבים.

בנוסף להיותו יציב במיוחד,RNases נמצאים בכל מקום במעבדה .RNase הוא מנגנון הגנה ביולוגי.עבור תא, RNA אקסוגני הוא לעתים קרובות קטלני.בהשוואה ל-DNA אקסוגני, RNA אקסוגני לרוב מסוכן יותר.RNA מתומלל ומתורגם בשמחה, כך שכמעט כל האורגניזמים פיתחו RNases כדי להתגונן מפני פלישת RNA אקסוגני.לכן, תאי החיידק המטופחים במעבדה ואתם שמוציאים RNA מוציאים את הארומה של RNase.נוזלי גוף אנושיים (רוק, דמעות וכו') מכילים כמות גדולה של RNase, אז אל תבכה כאשר ה-RNA מתפרק.ככל שאתה בוכה יותר, הפירוק ה-RNA גרוע יותר!!האחות דאייו אינה מתאימה למיצוי RNA!

בנוסף, העור העדין שלך מכיל גם הרבה RNase, וגם הטושים, הפיפטות, דלתות המקרר וידיות הדלת שהעור נגע בהם מכילים RNase.

עם כל כך הרבה השתוללות, בואו נסתכל איך להתמודד עם RNases.

הדבר הראשון שכולם חושבים עליו בעת הסרת RNA הואDEPC(דיאתיל פירוקרבונט).DEPC גורם לדנטורציה של החלבון בעיקר על ידי שילוב עם טבעת האימידאזול של הקבוצה הפעילה RNase histidine, ובכך מעכב את פעילות האנזים.DEPC של 0.1% יכולה להיות בעלת אפקט הסרה טוב יותר על RNAse, אך עלינו לשים לב ש-DEPC הוא מסרטן ידוע, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת השימוש בו.

עבור RNase, אנחנו צריכים להתחיל משני היבטים,הראשון הוא לעכב את הפעילות של RNase אנדוגני

ריאגנטים קונבנציונליים למיצוי RNA כגון guanidine isothiocyanate ו-DTT הכלולים ב-Trizol יכולים לפתוח את הקשר הדיסולפידי של RNase, אבל עדיין יש כמה RNases, במיוחד בדגימות רקמה, אז שימו לב לטמפרטורה נמוכה.

1.לטבול מיד את דגימת הרקמה בחנקן נוזלי לאחר הוצאתה, או בתמיסה מסחרית לשימור RNA.

2.לאחר חילוץ ה-RNA של דגימת התא, הוסיפו אותו לתמיסת התמוגה וסילקו אותו על קופסת הקרח

3. עדיף להשתמש בחנקן נוזלי לטחינה כאשר דגימות רקמות הומוגניות.בעת שימוש בהומוגנית חשמלית ללא חנקן נוזלי, שימו לב לקירור מלא של מתאם ההומוגנית.

השני הוא DNase אקסוגני

1.היו חמושים לגמרי, לבשו מעיל מעבדה, לובשים מסכה, והקפידו ללבוש זוג כפפות חדשות (אל תהיו חסכנים כל כך!! יש לציין שטריזול הוא סופר קורוזיבי, והוא גם חזק מאוד דרך כפפות, אז אל תטפטפו על הידיים).

2.כל קצות הפיפטה המשומשים, צינורות EP, צינורות PCR וציוד אחר חייבים להיות מטופלים ב-de-RNase.ניתן להשרות אותו ב-0.1% DEPC ולאחר מכן ללחוץ בלחץ גבוה.שימו לב לפעולה במנדף.עריצים מקומיים יכולים לקנות ישירות חומרים מתכלים להסרת אנזימים.

נ.ב.: תן לי לספר לך שיטה עצלנית.למרות שטמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה לא יכולים להסיר לחלוטין את RNase, זה יסיר חלק גדול ממנו.פי 2 של טמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה יש השפעה טובה, ולמיצוי RNA יש השפעה מועטה.

3.אלכוהול יכול לסנן חלבונים,כך שניתן לנגב את טבלת מיצוי ה-RNA עם 75% אלכוהול , וניתן לרסס כפפות גם באלכוהול.

4.יש לטפל גם בתמיסת המסת ה-RNA הסופית ובצינור הצנטריפוגה.מים DEPC הם תמיסת המסת RNA הנפוצה.בואו נדבר על שיטת ההכנה הנכונה של מי DEPC (זכור לארוז מחדש את ה-DEPC המסחרי כשאתה קונה אותו)

הוסף DEPC למים טהורים במיוחד ב-1:1000, נער היטב, הניחו לעמוד לילה ב-37 מעלות צלזיוס, ועיקור ב-121 מעלות צלזיוס בטמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה למשך 15 דקות.ניתן לאחסן מים של DEPC ב-20 מעלות צלזיוס במנות של 1 מ"ל.

לסיום, לסיכום: טמפרטורה נמוכה היא המפתח, חומרים מתכלים מטופלים היטב, חמושים לחלוטין ופחות דיבורים!

ובכן, זה הכל לגבי האסטרטגיה של היום.אני מאחל לך את כל ריכוז ה-RNA והטוהר שהזכרת.שניהם A260/A280 הם 2.0!!!

כמובן, אם אתה משתמש ב-aהפעלה בטמפרטורת החדר ערכת מיצוי RNA, ייתכן שלא תיתקל בבעיות שלעיל.

פעולה בטמפרטורת החדר, ללא הוספת DNase, מחלצת את סך ה-RNA מהתאים תוך 11 דקות, ומחלצת את ה-RNA הכולל מרקמות בעלי חיים או צמחים תוך 30 דקות.

לדוגמאות ניסיון, אנא צור קשר עם:overseas@foregene.com

מוצרים קשורים:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/