• PCR היא שיטה המשמשת להגברת DNA מכמות קטנה של תבנית DNA.RT-PCR משתמש בשעתוק הפוך כדי לייצר תבנית DNA ממקור RNA שניתן לאחר מכן להגביר.
• PCR ו-RT-PCR הם בדרך כלל תגובות נקודת קצה, בעוד ש-qPCR ו-RT-qPCR משתמשים בקינטיקה של קצב סינתזת המוצר במהלך תגובת ה-PCR כדי לכמת את כמות התבנית הקיימת.
• שיטות חדשות יותר, כגון PCR דיגיטלי, מספקות כמות מוחלטת של תבנית ה-DNA הראשונית, בעוד ששיטות כגון PCR איזותרמי מפחיתות את הצורך בציוד יקר כדי לספק תוצאות אמינות.

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה פשוטה יחסית בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית להגברה וזיהוי רצפי DNA ו-RNA.בהשוואה לשיטות המסורתיות של שיבוט והגברה של DNA, שלעיתים קרובות עשויות להימשך ימים, PCR דורש רק כמה שעות.PCR הוא רגיש מאוד ודורש תבנית מינימלית לזיהוי והגברה של רצפים ספציפיים.שיטות PCR בסיסיות התקדמו עוד יותר מזיהוי פשוט של DNA ו-RNA.להלן, סיפקנו סקירה כללית של שיטות ה-PCR השונות והריאגנטים שאנו מספקים ב-Enzo Life Sciences לצרכי המחקר שלך.אנו שואפים לעזור למדענים לגשת במהירות לראגנטים של PCR לשימוש בפרויקט המחקר הבא שלהם!

PCR

עבור PCR סטנדרטי, כל מה שאתה צריך זה פולימראז של DNA, מגנזיום, נוקלאוטידים, פריימרים, תבנית ה-DNA שיש להגביר ו-thermocycler.מנגנון ה-PCR הוא פשוט כמו מטרתו: 1) DNA דו-גדילי (dsDNA) הוא דנטורטי בחום, 2) פריימרים מיושרים לגדילי ה-DNA הבודדים, ו-3) הפריימרים מורחבים על ידי DNA פולימראז, וכתוצאה מכך שני עותקים של ה-DNA. גדיל DNA מקורי.תהליך הדנטורציה, החישול וההתארכות על פני סדרה של טמפרטורות וזמנים ידוע כמחזור אחד של הגברה (איור 1).

יש לבצע אופטימיזציה של כל שלב במחזור עבור התבנית וערכת הפריימר בשימוש.מחזור זה חוזר על עצמו כ 20-40 פעמים, ולאחר מכן ניתן לנתח את המוצר המוגבר, בדרך כלל על ידי ג'ל agarose (איור 2).

מכיוון ש-PCR היא שיטה רגישה ביותר ונדרשים נפחים קטנים מאוד לתגובות בודדות, מומלץ להכין תערובת מאסטר למספר תגובות.יש לערבב היטב את תערובת המאסטר ולאחר מכן לפצל לפי מספר התגובות, כדי להבטיח שכל תגובה תכיל את אותה כמות של אנזים, dNTPs ו-primers.ספקים רבים, כמו Enzo Life Sciences, מציעים גם תערובות PCR שכבר מכילות הכל מלבד פריימרים ותבנית ה-DNA.

אזורים עשירים בגואנין/ציטוזין (עשיר ב-GC) מייצגים אתגר בטכניקות PCR סטנדרטיות.רצפים עשירים ב-GC יציבים יותר מרצפים עם תוכן GC נמוך יותר.יתר על כן, רצפים עשירים ב-GC נוטים ליצור מבנים משניים, כגון לולאות סיכת ראש.כתוצאה מכך, קשה להפריד לחלוטין גדילים כפולים עשירים ב-GC במהלך שלב הדנטורציה.כתוצאה מכך, DNA פולימראז אינו יכול לסנתז את הגדיל החדש ללא הפרעה.טמפרטורת דנטורציה גבוהה יותר יכולה לשפר זאת, והתאמות לקראת טמפרטורת חישול גבוהה יותר וזמן חישול קצר יותר יכולות למנוע קישור לא ספציפי של פריימרים עשירים ב-GC.ריאגנטים נוספים יכולים לשפר את ההגברה של רצפים עשירים ב-GC.DMSO, גליצרול ובטאין עוזרים לשבש את המבנים המשניים הנגרמים על ידי אינטראקציות GC ובכך מקלים על ההפרדה של הגדילים הכפולים.

התחלה חמה PCR

הגברה לא ספציפית היא בעיה שיכולה להתרחש במהלך PCR.רוב פולימראזות ה-DNA המשמשות ל-PCR פועלות בצורה הטובה ביותר בטמפרטורות סביב 68°C עד 72°C.עם זאת, האנזים יכול להיות פעיל גם בטמפרטורות נמוכות יותר, אם כי במידה נמוכה יותר.בטמפרטורות הרבה מתחת לטמפרטורת החישול, פריימרים יכולים להיקשר באופן לא ספציפי ולהוביל להגברה לא ספציפית, גם אם התגובה מוגדרת על קרח.ניתן למנוע זאת על ידי שימוש במעכבי פולימראז שמתנתקים מה-DNA פולימראז רק ברגע שמגיעים לטמפרטורה מסוימת, ומכאן המונח Hot start PCR.המעכב יכול להיות נוגדן הקושר את הפולימראז ומדנטור בטמפרטורת הדנטורציה הראשונית (95 מעלות צלזיוס בדרך כלל).

High Fidelity Polymerase

בעוד שפולימראזות DNA מתגברות בצורה מדויקת למדי לרצף התבניות המקוריות, יכולות להתרחש טעויות בהתאמת נוקלאוטידים.חוסר התאמה ביישומים כגון שיבוט עלול לגרום לתמלילים קצוצים, ולחלבונים מתורגמים לא נכון או לא פעילים במורד הזרם.כדי למנוע אי-התאמה אלו, זוהו פולימראזות עם פעילות "הגהה" ושולבו בזרימת העבודה.פולימראז ההגהה הראשון, Pfu, זוהה בשנת 1991 ב- Pyrococcus furiosus.לאנזים Pfu זה פעילות אקסונוקלאז 3' עד 5'.כאשר ה-DNA מוגבר, האקסונוקלאז מסיר נוקלאוטידים לא תואמים בקצה 3' של הגדיל.לאחר מכן, הנוקלאוטיד הנכון מוחלף, וסינתזת ה-DNA נמשכת.הזיהוי של רצפי נוקלאוטידים שגויים מבוסס על זיקת הקישור לנוקלאוזיד טריפוספט הנכון עם האנזים, כאשר קשירה לא יעילה מאטה את הסינתזה ומאפשרת את ההחלפה הנכונה.פעילות ההגהה של Pfu פולימראז מביאה לפחות שגיאות ברצף הסופי בהשוואה לפולימראז של Taq DNA.בשנים האחרונות זוהו אנזימים אחרים להגהה, ובוצעו שינויים באנזים Pfu המקורי כדי להפחית עוד יותר את שיעור השגיאות במהלך הגברה של DNA.

RT-PCR

שיעתוק הפוך PCR, או RT-PCR, מאפשר שימוש ב-RNA כתבנית.שלב נוסף מאפשר זיהוי והגברה של RNA.ה-RNA מועתק לאחור ל-DNA משלים (cDNA), תוך שימוש ב-Reverse Transcriptase.האיכות והטוהר של תבנית ה-RNA חיוניים להצלחת RT-PCR.השלב הראשון של RT-PCR הוא סינתזה של היברידית DNA/RNA.ל-Reverse Transcriptase יש גם פונקציה של RNase H, אשר מפרקת את חלק ה-RNA של ההיברידית.לאחר מכן, מולקולת ה-DNA החד-גדילית הושלמה על ידי פעילות ה-DNA התלויה ב-DNA של ה-Reverse Transcriptase לתוך cDNA.היעילות של תגובת הגדיל הראשון יכולה להשפיע על תהליך ההגברה.מכאן ואילך, הליך ה-PCR הסטנדרטי משמש להגברת ה-cDNA.לאפשרות להחזיר RNA ל-cDNA על ידי RT-PCR יש יתרונות רבים, והיא משמשת בעיקר לניתוח ביטוי גנים.RNA הוא חד-גדילי ומאוד לא יציב, מה שהופך אותו למאתגר לעבוד איתו.זה משמש בדרך כלל כשלב ראשון ב-qPCR, המכמת את תמלול RNA בדגימה ביולוגית.

qPCR ו-RT-qPCR

PCR כמותי (qPCR) משמש לאיתור, אפיון וכימות חומצות גרעין עבור יישומים רבים.ב-RT-qPCR, תעתיקי RNA מכומתים לעתים קרובות על ידי שעתוק לאחור שלהם ל-cDNA תחילה, כמתואר לעיל, ולאחר מכן מתבצע qPCR לאחר מכן.כמו ב-PCR רגיל, ה-DNA מוגבר על ידי שלושה שלבים חוזרים: דנטורציה, חישול והתארכות.עם זאת, ב-qPCR, תיוג פלורסנט מאפשר איסוף נתונים עם התקדמות ה-PCR.לטכניקה זו יתרונות רבים בשל מגוון השיטות והכימיה הזמינים.

ב-qPCR מבוסס צבע (בדרך כלל ירוק), תיוג פלורסנט מאפשר לכימות של מולקולות ה-DNA המוגברות על ידי שימוש בצבע קושר dsDNA.במהלך כל מחזור, הקרינה נמדדת.אות הקרינה גדל באופן פרופורציונלי לכמות ה-DNA המשוכפל.לפיכך, ה-DNA מכומת ב"זמן אמת" (איור 3).החסרונות ל-qPCR מבוסס צבע הם שניתן לבחון רק מטרה אחת בכל פעם ושהצבע ייקשר לכל ds-DNA הקיים בדגימה.

ב-qPCR מבוסס-probe, ניתן לזהות מטרות רבות בו-זמנית בכל דגימה, אך הדבר דורש אופטימיזציה ועיצוב של בדיקה ספציפית ליעד המשמשת בנוסף לפריימרים.ישנם מספר סוגים של עיצובי בדיקה זמינים, אך הסוג הנפוץ ביותר הוא בדיקה הידרוליזה, המשלבת פלואורופור ומרווה.העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) מונעת את פליטת הפלואורפור דרך המרווה בזמן שהגשושית שלמה.עם זאת, במהלך תגובת ה-PCR, הפרוב עובר הידרוליזה במהלך הארכת פריימר והגברה של הרצף הספציפי אליו הוא קשור.הביקוע של הבדיקה מפריד בין הפלואורופור למרווה ומביא לעלייה תלויה בהגברה של הקרינה (איור 4).לפיכך, אות הקרינה מתגובת qPCR מבוססת בדיקה הוא פרופורציונלי לכמות רצף יעד הבדיקה הקיים בדגימה.מכיוון ש-qPCR מבוסס בדיקה הוא ספציפי יותר מ-qPCR מבוסס צבע, זוהי לרוב הטכנולוגיה המשמשת במבחני אבחון מבוססי qPCR.

הגברה איזותרמית

טכניקות ה-PCR שהוזכרו לעיל דורשות ציוד תרמו-מחזור יקר כדי להגביר ולהוריד במדויק את טמפרטורות החדר עבור שלבי הדנטורציה, החישול וההרחבה.פותחו מספר טכניקות שאינן זקוקות למכשירים כה מדויקים וניתן לבצען באמבט מים פשוט או אפילו בתוך התאים המעניינים.טכניקות אלו נקראות ביחד הגברה איזותרמית ועובדות על בסיס הגברה אקספוננציאלית, ליניארית או מדורגת.

הסוג המוכר ביותר של הגברה איזותרמית הוא הגברה איזותרמית בתיווך לולאה, או LAMP.LAMP משתמש בהגברה אקספוננציאלית ב-65⁰C כדי להגביר את ה-DNA או ה-RNA של תבנית.בעת ביצוע LAMP, משתמשים בארבעה עד שישה פריימרים המשלימים לאזורים ב-DNA היעד עם פולימראז של DNA כדי לסנתז DNA חדש.לשניים מהפריימרים הללו יש רצפים משלימים המזהים רצפים בפריימרים האחרים וקושרים אותם, ומאפשרים להיווצר מבנה "לולאה" ב-DNA החדש שסונתז, שמסייע לאחר מכן בחישול הפריימר בסבבים הבאים של הגברה.ניתן להמחיש את LAMP בשיטות מרובות, כולל פלואורסצנטי, אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז או קולורימטריה.הקלות של הדמיה וזיהוי נוכחות או היעדר של מוצר על ידי קולורימטריה והיעדר ציוד יקר הנדרש הפכו את LAMP לאופציה מתאימה לבדיקת SARS-CoV-2 באזורים שבהם בדיקות מעבדה קליניות לא היו זמינות, או אחסון והובלה של דגימות לא היה אפשרי, או במעבדות שלא היו להן בעבר ציוד תרמומחזור PCR.