תמלול הפוך מסורתי אינו יכול לסבול טמפרטורות גבוהות (הטמפרטורה האופטימלית לפעילות MMLV היא 37-50 מעלות צלזיוס, ו-AMV היא 42-60 מעלות צלזיוס).ה-RNA הנגיפי המורכב יותר לא יכול להיות מועתק ביעילות לאחור לתוך cDNA בטמפרטורות נמוכות, וכתוצאה מכך יעילות זיהוי ההפחתה.RT-qPCR מסורתי מצריך בדרך כלל השתתפות של שני אנזימים מרכזיים (טרנסקריפטאז הפוך ו-DNA פולימראז), מה שלא מאפשר לפשט את פעולת מערכת התגובה ולהפחית את העלות.כאן נציג שני תעתיקים הפוכים עמידים לטמפרטורה גבוהה, TtH ו-RevTaq.לשני האנזימים הללו יש גם תפקיד של DNA פולימראז, ולכן הם נקראים אנזימים דו-פונקציונליים.

TtH DNA פולימראז

בטח שמעתם על TtH, שמקורו בחיידק התרמופילי Thermus thermophilus HB8.בנוכחות קטיונים דו ערכיים כגון Mg2+, יש לו פעילות DNA פולימראז.הוא נמצא בשימוש נרחב בתגובות PCR כמו אנזים Taq, אבל יש לו עמידות חום גבוהה יותר מאנזים Taq, כך שיש לו גם השפעה טובה יותר על PCR עם תבניות תוכן GC גבוה.

· לאנזים זה בעצם אין פעילות 3′→5′ exonuclease ופעילות 5′→3′ exonuclease, כך שניתן להשתמש בו גם לרצף דידיאוקסי.

· לאנזים זה פעילות RTase.בנוכחות Mn2+, פעילות RTase תוגבר.באמצעות תכונה זו, ניתן להשתמש בה לביצוע תגובת שעתוק הפוכה ותגובת PCR באותו צינור, כלומר RT-PCR חד-שלבי.עם זאת, בנוכחות Mn2+, הדיוק של RT-PCR אינו גבוה.לפעילות RT אין שום קשר לפעילות rnaase H.

· הפעילות המוגברת של Tth-DNA פולימראז (pH9, אופטימלי +55℃～+70℃, מקסימום +95℃) מתגברת על הבעיות הנגרמות ממבנה משני של RNA.ניתן להגביר את ה-cDNA המתקבל על ידי PCR עם אותו אנזים בנוכחות יוני Mg2+.

· היכולת של Tth-DNA פולימראז לבצע שעתוק הפוך והגברת DNA בטמפרטורות גבוהות הופכת את האנזים הזה לשימושי עבור RT-PCR כמותי, שיבוט וניתוח ביטוי גנים של RNA תאי ווירלי.
· Tth-DNA פולימראז משמש ל-RT-PCR להגברת RNA עד 1kb.

תכונות ויתרונות

Tth DNA פולימראז:

• ודא את גודל המוצר האופטימלי של תגובת שרשרת הפולימראז (PCR), לפחות 1000 bp בתגובת RT-PCR

• לקבל deoxyribonucleoside triphosphate שונה כמצע

• לא קשור לפעילות RNase H

• בעל יציבות תרמית גבוהה כדי להתגבר על בעיות, בדרך כלל קשורה למבנה המשני הגבוה הקיים ב-RNA

RevTaq RT-PCR DNA פולימראז

פולימראז DNA עמיד לחום עם פעילות טרנסקריפטאזה הפוכה

RevTaq-RT-PCR-DNA פולימראז הוא אנזים מהונדס, עמיד מאוד בחום, דו-פונקציונלי עם פעילויות טרנסקריפטאז הפוך ו-DNA פולימראז המתקבלות באמצעות אבולוציה מכוונת ומלאכותית.

· זמן מחצית החיים של RevTaq RT-PCR DNA פולימראז ב-95°C גדול מ-40 דקות.

· RevTaq RT-PCR DNA פולימראז מאפשר שעתוק הפוך בטמפרטורה גבוהה ישירות מתבנית ה-RNA, וניתן לחזור על שלב השעתוק ההפוך מספר פעמים ליצירת תבניות cDNA נוספות.

· RevTaq RT-PCR DNA פולימראז מאפשר RT-PCR "אפס צעד" (ללא שלב שעתוק הפוך איזותרמי), מכיוון שבשלב הארכת PCR המחזורי, שעתוק הפוך והגברת DNA מתרחשים בו זמנית.זה גם מקדם את תגובת השעתוק ההפוכה בטמפרטורות גבוהות, ובכך ממזער את הבעיות שבהן נתקלים בהמסת המבנה המשני החזק ב-RNA בטמפרטורות גבוהות.

· בשל נוסחת ההתחלה החמה המבוססת על aptamer, RevTaq RT-PCR DNA פולימראז יפיק תוצאות טובות יותר כאשר טמפרטורת החישול והארכה גבוהה מ-57°C.

· מאחר והאנזים עמיד בחום, מומלץ לתכנן פריימרים ופרובים בעלי נקודות התכה גבוהות מאוד (>60 מעלות צלזיוס).

· מומלץ לייעל את הטמפרטורה של שלב החישול/הרחבה באמצעות שיפוע טמפרטורה במהלך תהליך הגדרת התגובה.

· ככל שהטמפרטורה גבוהה יותר, כך הספציפיות של PCR גבוהה יותר.מחזור השעתוק ההפוך מבוצע בדרך כלל בטמפרטורה גבוהה יותר ממחזור ה-PCR, מכיוון שהכלאה של DNA Primer:RNA Template היא בדרך כלל בעלת נקודת התכה גבוהה יותר מאשר DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA פולימראז מהונדס גנטית ומוטב, וגודל האמפליקון הוא בין 60-300 bp.

מגבלת הזיהוי של RevTaq RT-PCR DNA פולימראז מגיעה ל-4 עותקים/

מערכת התגובה האופטימלית (הקמת פריימרים בנקודת התכה גבוהה) מוצגת באיור.RT-PCR מונע על ידי RevTaq RT-PCR DNA-פולימראז מראה רגישות טובה יותר מ-TaqPath 1-שלבי RT-qPCR תמהיל מאסטר, וזיהוי נמוך יותר של דילול מדגם.

יתרונות נוספים:

פונקציית התחלה מהירה ← ניתן לדלג על שלב הדנטורציה התרמי הראשוני.

פורמולת aptamer עם התחלה חמה ← לספק 100% פעילות אנזים באופן מיידי ולמנוע הגברה לא ספציפית בטמפרטורות נמוכות (<57°C).

פונקציית המחשוף ← שלב מיצוי ה-RNA מושמט, מכיוון שפולימראז DNA של RevTaq RT-PCR יכול גם לעבד דגימות תגובה גולמיות.זה יכול להרוס מיד את קרומי התא של אוקריוטים, חיידקים ווירוסים במחזור RT-PCR חם.

רמת חומר גלם IVD → תקני איכות גבוהים ומחירים תחרותיים במיוחד