טיפים לשיפור שחזור הדבק

1. הגדל את עומס הדגימה במהלך אלקטרופורזה.

2. השתמש במאגר אלקטרופורזה טרי שהוכן.

3. בעת חיתוך דבק, נסה לחתוך רק את הדבק עם רצועות כדי להפחית את נפח חיתוך הדבק: אין צורך בדבק עם מעט שברי מטרה, אחרת זה ישפיע על קצב ההחלמה.

4. לאחר המסת שתי חתיכות דבק או יותר, השתמשו בצינור לא משנה כמה גדול הנפח והעבירו לאותו עמוד.

5. התמיסה המוספת בסול יכולה להיות מעט יותר, מה שמסייע יותר לקשירת ה-DNA לממברנה, אך בדרך כלל לא תעלה על 750ul.

6. המפתח לשחזור ג'ל הוא לקשור DNA לעמוד באמצעות ריכוז המלח, החומציות (המטען) וההידרופוביות של התמיסה בעמודה.לכן, אם ה-pH של חיץ האלקטרופורזה גבוה מדי, ניתן להוסיף 10ul (pH 5.0, 3mol/L NaAC) לסול;על מנת ליירט טוב יותר מולקולות DNA על הממברנה, ניתן להוסיף 30% איזופרופנול לחימום לנוזל לאחר המסת הדבק.

7. לפני הוספת המנקה, השאר את העמודה בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות (כ-10 דקות) לאידוי מלא של האתנול.

8. לבסוף, הוסף פחות חומר eluent כדי למזער את נפח ההתאוששות.בדרך כלל, eluent 30-50μl משמש עבור eluent (לא מעט מדי, אחרת הוא לא יוכל להרטיב את הממברנה, אשר אינו תורם eluation);טיפות האלוציה נמצאות במרכז הממברנה, כדי לחלוט במלואו את ה-DNA הקשור לממברנה.

9. לאחר הוספת המחלף ניתן לחפוף אותו באמבט מים של 55 מעלות למשך 5 דקות או להכניסו לאמבט מים של 50 מעלות ליותר מ-10 דקות, או לאטום בפאראפלם ב-4 מעלות למשך הלילה, ולאחר מכן לצנטריפוגה להתאוששות למחרת, ההשפעה טובה.

10. הוסף את ה-eluate הצנטריפוגה בחזרה לעמודת הספיחה וצנטריפוגה שוב.

שיטות ונהלים מפורטים לשחזור מוצר PCR

1. מיחזור גומי רגיל

אם ברצונכם לשחזר את הדבק, עדיף להשתמש בערכה, נוחה ובעלת קצב התאוששות מעט גבוה יותר.אם אתה באמת צריך לשחזר אותו באופן ידני, אתה יכול להוסיף פי 3 מנפח TE לאחר חיתוך הדבק.לאחר המסה באמבט מים, פנול, פנול/כלורופורם מופקים בצורה נקייה, ומשקעים אתנול.זהו זה.

2. שחזור DNA מג'לים בנקודת התכה נמוכה

טיהור של שברי DNA הוסף TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8.0, 0.1 mmol/l EDTA) שווה לנפח הג'ל, והנח באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להמיס את הג'ל לחלוטין.

לאחר שהובא לטמפרטורת החדר, נוספה כמות שווה של פנול (רווי TE, TE נאטם בשכבה העליונה והוסרה שכבת הפנול התחתונה), והתערובת עורבבה בעדינות (אין צורך בערבוב), וצנטריפוגה ב-12,000 סל"ד למשך 3 דקות.חזור 1-2 פעמים.

קח את הסופרנטנט, הוסף 0.1 נפח של 3mol/L נתרן אצטט (pH 5.2) ופי 2.5 נפח של אתנול מוחלט כדי לבצע משקעים אתנול.ממיסים את ה-DNA המטוהר עם כמות מתאימה של TE, מדוד את התוכן, ומתכונן לשימוש (ניתן להשתמש בו לניתוח מבנה גן מטרה, הכנת בדיקה וכו').

3. שחזור PCR עם סגוליות הגברה טובה

אם הספציפיות של הגברה PCR טובה, זה רק טיהור ושחזור פשוטים של מוצר ה-PCR.אתה יכול להוסיף 50ug/ml proteinase K למוצר PCR, 37 מעלות למשך שעה, לחלץ פעם אחת עם פנול/כלורופורם, לחלץ פעם אחת עם כלורופורם ולהוסיף 0.1 נפח של הסופרנטנט.נתרן אצטט הוחזר על ידי משקעים עם 2.5 נפחים של אתנול מוחלט.

מוצרים קשורים:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/