לאחרונה גיליתי משהו מדהים!אנשי מקצוע מתקדמים בניסויים רבים סביבו אפילו לא יודעים כמה נקודות ידע ניסיוני בסיסיות מאוד.

לדוגמה, האם תוכל לענות על השאלות הבאות?

האם יש הבדל בין OD260 ל-A260?מה המשמעות של כל אחד?
OD הוא קיצור של צפיפות אופטית (צפיפות אופטית), A הוא קיצור של ספיגה (ספיגה), שני המושגים הם למעשה זהים, "צפיפות אופטית" היא "צפיפות אופטית", אך "צפיפות אופטית" עולה בקנה אחד עם רוב התקנים הלאומיים ויותר סטנדרטית.

בדרך כלל אנו מודדים את ערך ה-OD ב-260nm כדי לחשב את ריכוז חומצת הגרעין, אז מה מייצג 1OD?
לחומצת גרעין יש שיא ספיגה מקסימלי באורך גל של 260 ננומטר, המכילה גם DNA וגם RNA, כמו גם שברי חומצת גרעין מפוצלים (זו נקודת המפתח).
ערך ה-OD שנמדד באורך גל של 260 ננומטר נרשם כ-OD260.אם הדגימה טהורה, ערך OD260 יכול לחשב את הריכוז של דגימת חומצת הגרעין.
1 OD260=50 מיקרוגרם/מ"ל dsDNA (DNA דו-גדילי)
=37 מיקרוגרם/מ"ל ssDNA (DNA חד-גדילי)
=40 מיקרוגרם/מ"ל RNA
=30 מיקרוגרם/מ"ל dNTPs (אוליגונוקלאוטידים)
האם יש קשר והבדל בין RT-PCR, Realtime-PCR ו-QPCR?
RT-PCR הוא קיצור של Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, קיצור של Quantitative Real Time PCR
למרות שבזמן אמת PCR (PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת) ו-Reverse Transcription PCR (Reverse Transcription PCR) נראה שניהם מקוצרים כ-RT-PCR.אבל האמנה הבינלאומית היא: RT-PCR מתייחס ספציפית ל-PCR שעתוק הפוך.

מהם ה-nt, bp ו-kb הנפוצים לתיאור אורך ה-DNA/RNA בביולוגיה?
nt = נוקלאוטיד
bp = זוג בסיסים זוג בסיסים
kb = קילובסיס

כמובן, הייתם אומרים שלהרבה אנשים לא אכפת מהפרטים הקטנים האלה!כולם עושים את זה, ואף אחד לא ישאל אותך מה זה.אתה יודע שזה מיותר, נכון?

לא, לא, לא, זה מאוד הכרחי לדעת את זה!בגלל מה?
כי אתה רוצה לפרסם מאמר!אָח!בין אם אתם שואפים לסיום הלימודים ובין אם אתם שואפים להישגי מחקר מדעיים, עליכם להסתמך על מאמרים כדי לדבר!

מיצוי חומצת גרעין צריך להיות הניסוי הפשוט והבסיסי ביותר.איכות מיצוי חומצת הגרעין קובעת ישירות את תוצאות הניסויים הבאים.

למרות שאמרתי את זה הרבה פעמים, עדיין יש הרבה חברים שלא אכפת להם.הפעם החלטתי לצאת מהכתבה!

מידע מינימלי לפרסום של ניסויי PCR כמותיים בזמן אמת, המכונה MIQE, היא קבוצה של הנחיות ניסוי כמותי פלואורסצנטי שהושקה בינלאומית, המציעה סטנדרטים מינימליים למידע הניסיוני הדרוש להערכת ניסויי PCR כמותי פלואורסצנטי ופרסום מאמרים.באמצעות תנאי הניסוי ושיטות הניתוח שסופק על ידי הנסיין, הסוקרים יכולים להעריך טוב יותר את תקפות תכנית הניסוי של החוקר.

ניתן לראות שבקטע של מיצוי חומצת גרעין, הוצעו פריטי הגילוי הבאים:

"E" מציין מידע שיש לספק ו-"D" מציין מידע שיש לספק במידת הצורך.

הטופס מאוד מסובך, למעשה, אני רוצה לומר שכולם צריכים להתחיל ממנו

טוהר (D), תשואה (D), שלמות (E) ועקביות (E) כדי להעריך חומצות גרעין בארבעת ההיבטים הללו.

על פי הרגלי ניסוי, דבר ראשון על שיטות ההערכה של טוהר וריכוז.

מדידת OD היא שיטת הזיהוי המועדפת והקלה ביותר עבור נסיינים.לגבי העיקרון, לא אכנס כאן לפרטים.מעבדות רבות משתמשות כיום בספקטרופוטומטרים אולטרה-מיקרו כדי לנתח באופן כמותי דגימות של חומצות גרעין.בזמן הצגת ערך הספיגה, התוכנית נותנת ישירות את ערך הריכוז (חומצת גרעין, חלבון וצבע ניאון) ויחסים קשורים.באשר לניתוח של ערך ה-OD, שמור את התמונה ואתה תהיה בסדר.

רשימת פתרונות ערכי OD אוניברסליים

עם זאת, יש כמה אזהרות שצריך להביא בנפרד עבורך.

(אחרי הכל, אני יודע שאתם חייבים להיות אלה שחוסכים ומחכים עד שתזדקקו להם!)

הערה 1 ציוד

ערך ה-OD יושפע מציוד שונה.כל עוד ה-OD260 נמצא בטווח מסוים, הערכים של OD230 ו-OD280 הם בעלי משמעות.לדוגמה, טווח הספיגה של Eppendorf D30 הנפוץ ב-260nm הוא 0~3A, וה-NanoDrop One של Thermo הוא ב-260nm.טווח הספיגה של 0.5~62.5A.

פתק 2ריאגנט דילול

ערך ה-OD יכול להיות מושפע מדילול של ריאגנטים שונים.לדוגמה, קריאת OD260/280 של RNA מטוהר ב-pH7.5 10 מ"מ טריסחוצץ הוא בין 1.9-2.1, תוך כדיתמיסה מימית ניטרליתהיחס יהיה נמוך יותר, אולי רק 1.8-2.0, אבל זה לא אומר שאיכות ה-RNA משתנה.

פתק 3חומרים שאריות

קיומם של חומרים שיוריים ישפיע על הדיוק של מדידת ריכוז חומצות גרעין, ולכן יש להימנע ככל האפשר משאריות חלבון, פנול, פוליסכריד ופוליפנול בדגימות חומצות גרעין.

עם זאת, למעשה, מיצוי עם ריאגנטים אורגניים היא שיטה ישנה.בערכות מסחריות ניתן להשיג את אפקט המיצוי באמצעות עמודת ספיחה על בסיס סיליקה בשילוב צנטריפוגה, הימנעות מגיבים אורגניים רעילים ומזיקים שקשה להסרה וכו' הבעיה כמו למשלערכת מיצוי חומצות הגרעין של Foregene, אינה משתמשת ב-DNase/RNase ובריאגנטים אורגניים רעילים לאורך כל הפעולה, מהירה ובטוחה, והההשפעה היאטוֹב(אמרתי בטעות שזה קירח, אבל אני יודע שאתה רוצה לדעת).

דוגמה 1: תפוקת מיצוי DNA גנומי וטוהר

ערכת בידוד DNA של קרקע Foregene (DE-05511) מטפלת בדגימות קרקע ממקורות שונים, והכמות והטוהר של ה-DNA הגנומי המתקבל מוצגים בטבלה הבאה:
דוגמה 2: תפוקה וטוהר של מיצוי RNA של רקמות

ערכת הבידוד הכוללת RNA של בעלי חיים (RE-03012) עיבדה דגימות רקמה שונות, והכמות והטוהר של ה-RNA שהתקבלו מוצגים בטבלה שלהלן (עבור רקמת עכבר):
עם זאת, אל תחשוב שסיימת עם ערך ה-OD.האם יש לך לטפל בנקודות המפתח שציירתי לך בחזית?

הודעה

גם מולקולות חומצת גרעין מפוצלות יחושבו בספיגה.בהנחה שיש לך שאריות DNA גנומי ב-RNA, ערך ה-OD שלך ייראה גבוה מאוד, אך לא ניתן לקבוע את הריכוז האמיתי של ה-RNA.אם ה-RNA שלך הוא לא ברור אם קיימת השפלה, אז אנחנו עדיין צריכים שיטת הערכה מקיפה כדי לתת שיפוט מדויק יותר, כלומר, הערכת שלמות חומצת הגרעין המוזכרת ב-MIQE.