סקירה כללית
זיהוי מהיר של צמחים מהונדסים
טקסט/טונג יוצ'נג
פעולה נסיונית/האן יינג
עורך/ון יוג'ון
מילים/1600+
זמן קריאה מוצע/8-10 דקות
זיהוי מהיר של צמחים מהונדסים
בתור עולה חדש במעבדה, זו לא עבודה טובה לסנן צמחים חיוביים מחבורה של צמחים עם שיעור המרה נמוך.ראשית, יש לחלץ DNA ממספר רב של דגימות אחת אחת, ואז הגנים הזרים יתגלו באמצעות PCR.עם זאת, התוצאות הן לעתים קרובות ריקים ורצועות עם כמה פריטים מדי פעם, אך אי אפשר לקבוע אם יש גילויים שהוחמצו או זיהוי שווא..האם זה מאוד חסר אונים להתמודד עם תהליך ותוצאות ניסויים כאלה?אל תדאג, אחי מלמד אותך כיצד לסנן צמחים חיוביים מהונדסים בקלות ובדייקנות.
שלב 1: עיצוב פריימרים לזיהוי
קבעו את הגן האנדוגני והגן האקסוגני שיתגלו בהתאם לדגימה שתיבדק, ובחרו רצף מייצג של 100-500bp בגן לעיצוב פריימר.פריימרים טובים יכולים להבטיח את הדיוק של תוצאות הגילוי ולקצר את זמן הגילוי (ראה נספח לפריימרים לזיהוי נפוצים).
הערה:
הפריימרים החדשים שתוכננו צריכים לייעל את תנאי התגובה ולאמת את הדיוק, הדיוק ומגבלת הזיהוי של הזיהוי לפני ביצוע זיהוי בקנה מידה גדול.
שלב 2:פיתוח פרוטוקול ניסיוני
בקרה חיובית: השתמש ב-DNA המטוהר המכיל את קטע המטרה כתבנית כדי לקבוע אם מערכת התגובה והתנאים של PCR תקינים.
שליטה שלילית/ריקה: השתמש בתבנית DNA או ddH2O שאינו מכיל את קטע המטרה כתבנית לזיהוי האם קיים מקור זיהום במערכת ה-PCR.
בקרת התייחסות פנימית: השתמש בשילוב ה-primer/probe של הגן האנדוגני של הדגימה לבדיקה כדי להעריך אם ניתן לזהות את התבנית באמצעות PCR.
הערה:
יש להגדיר בקרות חיוביות, שליליות/ריקות ובקרה פנימית עבור כל בדיקה כדי להעריך את תקפות תוצאות הניסוי.
שלב 3: הכנת ניסוי
לפני השימוש, בדוק אם התמיסה מעורבבת באופן שווה.אם נמצאו משקעים, יש להמיס אותם ולערבב לפי ההוראות לפני השימוש.2×PCR תערובת צריך להיות פיפטה ולערבב שוב ושוב עם micropipette לפני השימוש כדי למנוע פיזור יונים לא אחיד.
הערה:
הוציאו את ההוראות וקראו אותן בעיון, ועשו הכנות לפני הניסוי בהתאם להנחיות.
שלב 4: הכן מערכת תגובת PCR
על פי פרוטוקול הניסוי, ערבבו את הפריימרים, H2O, 2×PCR לערבב, לצנטריפוגה ולהפיץ אותם לכל צינור תגובה.
הערה:
לבדיקות בקנה מידה גדול או לטווח ארוך, מומלץ להשתמש במערכת תגובה PCR המכילה אנזים UNG, שיכולה למנוע ביעילות זיהום אירוסול הנגרם על ידי מוצרי PCR.
שלב 5: הוסף תבנית תגובה
באמצעות טכנולוגיית Direct PCR, אין צורך בתהליך טיהור מייגע של חומצות גרעין.ניתן להכין את תבנית המדגם תוך 10 דקות ולהוסיף למערכת התגובה ה-PCR המתאימה.
הערה:
לשיטת Lysis יש אפקט זיהוי טוב יותר, והמוצר המתקבל יכול לשמש לתגובות זיהוי מרובות.
5.1: PCR ישיר של עלים
לפי גודל התמונה במדריך, חותכים את רקמת העלה בקוטר של 2-3 מ"מ ומניחים אותה במערכת התגובה PCR.
הערה: ודא כי שברי העלים שקועים לחלוטין בתמיסת תגובת PCR, ואל תוסיף רקמת עלים מוגזמת.
5.2: שיטת תמוגה עלים
חותכים את רקמת העלים בקוטר של 5-7 מ"מ ומניחים אותה בצינור צנטריפוגה.אם אתה בוחר בעלים בוגרים, נא להימנע משימוש ברקמות של הווריד הראשי של העלה.לטפטף 50ul Buffer P1 lysate לתוך שפופרת צנטריפוגה כדי להבטיח כי lysate יכול לטבול לחלוטין את רקמת העלים, הנח אותו במחזור תרמי או אמבט מתכת, lyse ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
הוסף 50 ul תמיסת ניטרול Buffer P2 וערבב היטב.ניתן להשתמש בליסט המתקבל כתבנית ולהוסיף למערכת התגובה PCR.
הערה: כמות התבנית צריכה להיות בין 5-10% ממערכת ה-PCR, ולא תעלה על 20% (לדוגמה, במערכת PCR של 20μl, הוסף 1-2μl של חיץ תמוגה, לא יותר מ-4μl).
שלב 6: תגובת PCR
לאחר צנטריפוגה של צינור התגובה של PCR, הנח אותם במכשיר PCR להגברה.
הערה:
התגובה משתמשת בתבנית לא מטוהרת להגברה, כך שמספר מחזורי ההגברה הוא 5-10 מחזורים יותר מאשר בשימוש בתבנית DNA מטוהרת.
שלב 7: איתור אלקטרופורזה וניתוח תוצאות
M:100bp DNA Ladder
1\4: שיטת DNA מטוהר
2\5: שיטת PCR ישירה
3\6: שליטה ריקה
בקרת איכות:
תוצאות הבדיקה של הבקרות השונות שנקבעו בניסוי צריכות לעמוד בתנאים הבאים.אחרת, יש לנתח את הגורם לבעיה, ולבצע שוב את הבדיקה לאחר ביטול הבעיה.
טבלה 1. תוצאות בדיקה תקינות של קבוצות ביקורת שונות
*כאשר הפלסמיד משמש כבקרה חיובית, תוצאת בדיקת הגנים האנדוגנית יכולה להיות שלילית
שיפוט התוצאה:
א. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה היא שלילית, מה שמעיד על כך שלא ניתן לחלץ מהדגימה את ה-DNA המתאים לזיהוי PCR רגיל או שה-DNA המופק מכיל מעכבי תגובת PCR, ויש לחלץ שוב את ה-DNA.
ב. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה היא חיובית, ותוצאת הבדיקה של הגן האקסוגני היא שלילית, מה שמעיד על כך שה-DNA המתאים לגילוי PCR רגיל מופק מהדגימה, וניתן לשפוט שהגן XXX אינו מזוהה בדגימה.
ג. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה חיובית, ותוצאת הבדיקה של הגן האקסוגני חיובית, מה שמעיד על כך שהופק מהדגימה ה-DNA המתאים לזיהוי PCR רגיל, וה-DNA המדגם מכיל את הגן XXX.ניתן לבצע ניסויי אישור נוספים.
שלב 8: עיצוב פריימרים לזיהוי
לאחר הניסוי, השתמש בתמיסת נתרן היפוכלוריט 2% ובתמיסת אתנול 70% כדי לנגב את אזור הניסוי כדי למנוע זיהום סביבתי.
נִספָּח
טבלה 2. פריימרים נפוצים לזיהוי PCR כללי של צמחים מהונדסים גנטית
מסמך עזר:
SN/T 1202-2010, שיטת זיהוי PCR איכותית למרכיבים צמחיים מהונדסים גנטית במזון.
הודעת משרד החקלאות 1485-5-2010, בדיקת המרכיבים של צמחים מהונדסים גנטית ומוצריהם - אורז M12 ונגזרותיו.
זמן פרסום: יוני-09-2021
