בתור אחד חדש במעבדה, זו לא עבודה טובה לסנן צמחים חיוביים מחבורה של צמחים עם שיעור המרה נמוך.ראשית, יש לחלץ DNA ממספר רב של דגימות אחת אחת, ואז הגנים הזרים יתגלו באמצעות PCR.עם זאת, התוצאות הן לעתים קרובות ריקים ורצועות עם כמה פריטים מדי פעם, אך אי אפשר לקבוע אם יש גילויים שהוחמצו או זיהוי שווא..האם זה מאוד חסר אונים להתמודד עם תהליך ותוצאות ניסויים כאלה?אל תדאג, אחי מלמד אותך כיצד לסנן צמחים חיוביים מהונדסים בקלות ובדייקנות.

שלב 1

עיצוב פריימרים לזיהוי

קבעו את הגן האנדוגני והגן האקסוגני שיתגלו בהתאם לדגימה שתיבדק, ובחרו רצף מייצג של 100-500bp בגן לעיצוב פריימר.פריימרים טובים יכולים להבטיח את הדיוק של תוצאות הגילוי ולקצר את זמן הגילוי (ראה נספח לפריימרים לזיהוי נפוצים).

שים לב: הפריימרים החדשים שתוכננו צריכים לייעל את תנאי התגובה ולאמת את הדיוק, הדיוק ומגבלת הזיהוי של הזיהוי לפני זיהוי בקנה מידה גדול.

שלב 2

עיצוב פרוטוקול ניסיוני

בקרה חיובית: השתמש ב-DNA המטוהר המכיל את קטע המטרה כתבנית כדי לקבוע אם מערכת התגובה והתנאים של PCR תקינים.

בקרה שלילית/ריקה: השתמש בתבנית ה-DNA או ב-ddH2O שאינה מכילה את קטע המטרה כתבנית כדי לזהות אם קיים מקור זיהום במערכת ה-PCR.

בקרת התייחסות פנימית: השתמש בשילוב ה-primer/probe של הגן האנדוגני של הדגימה לבדיקה כדי להעריך אם ניתן לזהות את התבנית באמצעות PCR.

הודעה:

יש להגדיר בקרות חיוביות, שליליות/ריקות ובקרה פנימית עבור כל בדיקה כדי להעריך את תקפות תוצאות הניסוי.

הכנת ניסוי

לפני השימוש, בדוק אם התמיסה מעורבבת באופן שווה.אם נמצאו משקעים, יש להמיס אותם ולערבב לפי ההוראות לפני השימוש.2×PCR תערובת צריך להיות פיפטה ולערבב שוב ושוב עם micropipette לפני השימוש כדי למנוע פיזור יונים לא אחיד.

הודעה:

הוצא את המדריך וקרא אותו בעיון, ועשה הכנות לפני הניסוי בהתאם לדרישות המדריך.

שלב 4

הכן מערכת תגובה PCR

על פי פרוטוקול הניסוי, ערבבו את הפריימרים, H2O ו-2×PCR לערבב באופן שווה, צנטריפוגה והפיצו אותם לכל צינור תגובה.

הודעה:

לבדיקות בקנה מידה גדול או לטווח ארוך, מומלץ להשתמש במערכת תגובה PCR המכילה אנזים UNG, שיכולה למנוע ביעילות זיהום אירוסול הנגרם על ידי מוצרי PCR.

שלב 5

הוסף תבנית תגובה

באמצעות טכנולוגיית Direct PCR, אין צורך בתהליך טיהור מייגע של חומצות גרעין, ניתן להכין את תבנית הדגימה תוך 10 דקות, ולהוסיף את מערכת התגובה PCR המתאימה.

הודעה:

לשיטת המחשוף יש אפקט זיהוי טוב יותר, וניתן להשתמש במוצר המתקבל לריבוי תגובות זיהוי.

5.1: התרחבות ישירה של עלים

לפי גודל התמונה במדריך, חותכים את רקמת העלה בקוטר של 2-3 מ"מ ומניחים אותה במערכת התגובה PCR.

הערה: ודא כי שברי העלים שקועים לחלוטין בתמיסת תגובת PCR, ואל תוסיף רקמת עלים מוגזמת.

5.2: שיטת פיצול עלים

חותכים את רקמת העלים בקוטר של 5-7 מ"מ ומניחים אותה בצינור צנטריפוגה.אם אתה בוחר בעלים בוגרים, נא להימנע משימוש ברקמות של הווריד הראשי של העלה.לטפטף 50ul Buffer P1 lysate לתוך שפופרת צנטריפוגה כדי להבטיח כי lysate יכול לטבול לחלוטין את רקמת העלים, הנח אותו במחזור תרמי או אמבט מתכת, lyse ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.

הוסף 50 ul תמיסת ניטרול Buffer P2 וערבב היטב.ניתן להשתמש בליסט המתקבל כתבנית ולהוסיף למערכת התגובה PCR.

הערה: כמות התבנית היא בין 5-10% ממערכת ה-PCR, ולא תעלה על 20% (לדוגמה, במערכת PCR של 20μl, הוסף 1-2μl של תמיסת תמוגה, לא יותר מ-4μl).

שלב 6

תגובת PCR

לאחר צנטריפוגה של צינור התגובה של PCR, הוא ממוקם במכשיר PCR להגברה.

הודעה:

התגובה משתמשת בתבנית לא מטוהרת להגברה, כך שמספר מחזורי ההגברה הוא 5-10 מחזורים יותר מאשר בשימוש בתבנית DNA מטוהרת.

שלב 7

איתור אלקטרופורזה וניתוח תוצאות

M: סולם DNA 100bp

1\4: שיטת DNA מטוהר

2\5: שיטת PCR ישירה

3\6: שליטה ריקה

QC:

תוצאות הבדיקה של הבקרות השונות שנקבעו בניסוי צריכות לעמוד בתנאים הבאים.אחרת, יש לנתח את הגורם לבעיה, ולבצע שוב את הבדיקה לאחר ביטול הבעיה.

טבלה 1. תוצאות בדיקה תקינות של קבוצות ביקורת שונות

*כאשר הפלסמיד משמש כבקרה חיובית, תוצאת בדיקת הגנים האנדוגנית יכולה להיות שלילית

שיפוט התוצאה:

א. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה היא שלילית, מה שמעיד על כך שלא ניתן לחלץ מהדגימה את ה-DNA המתאים לזיהוי PCR רגיל או שה-DNA המופק מכיל מעכבי תגובת PCR, ויש לחלץ שוב את ה-DNA.

ב. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה חיובית, ותוצאת הבדיקה של הגן האקסוגני היא שלילית, מה שמעיד על כך שמופק מהדגימה DNA המתאים לזיהוי PCR רגיל, וניתן לשפוט שהגן XXX אינו מזוהה בדגימה.

ג. תוצאת הבדיקה של הגן האנדוגני של הדגימה חיובית, ותוצאת הבדיקה של הגן האקסוגני חיובית, מה שמעיד על כך שהופק מהדגימה DNA המתאים לזיהוי PCR רגיל, וה-DNA המדגם מכיל את הגן XXX.ניתן לבצע ניסויי אישור נוספים.

שלב 8

עיצוב פריימרים לזיהוי

לאחר הניסוי, השתמש בתמיסת נתרן היפוכלוריט 2% ובתמיסת אתנול 70% כדי לנגב את אזור הניסוי כדי למנוע זיהום סביבתי.