RT-qPCR פותח מטכנולוגיית PCR רגילה.הוא מוסיף כימיקלים פלואורסצנטיים (צבעים ניאון או בדיקות פלואורסצנטיות) למערכת תגובת PCR המסורתית, ומזהה את תהליך החישול והארכת PCR בזמן אמת בהתאם למנגנוני הזוהר השונים שלהם.שינויים באות ניאון במדיום משמשים לחישוב כמות השינוי במוצר בכל מחזור של PCR.נכון לעכשיו, השיטות הנפוצות ביותר הן שיטת צבע פלואורסצנטי ושיטת בדיקה.

שיטת צבע פלורסנטי:
חלק מהצבעים הפלורסנטיים, כגון SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO וכו', אינם פולטים אור בעצמם, אלא פולטים פלואורסצנטיות לאחר חיבור לחריץ הקטן של dsDNA.לכן, בתחילת תגובת ה-PCR, המכונה לא יכולה לזהות את האות הפלורסנט.כאשר התגובה ממשיכה לשלב ההארכה (שיטת שני שלבים) או הרחבה (שיטת שלושת השלבים), הגדילים הכפולים נפתחים בזמן זה, וה-DNA פולימראז החדש במהלך סינתזת הגדיל, מולקולות פלואורסצנטיות משולבות בחריץ הקטן של dsDNA ופולטות פלואורסצנטיות.ככל שמספר מחזורי ה-PCR גדל, יותר ויותר צבעים מתחברים עם dsDNA, וגם האות הפלורסנטי משתפר ללא הרף.קח את SYBR Green Ⅰ כדוגמה.
שיטת בדיקה:
בדיקה של טקמן היא בדיקה הידרוליזה הנפוצה ביותר.ישנה קבוצה פלואורסצנטית בקצה 5′ של הגשושית, בדרך כלל FAM.הבדיקה עצמה היא רצף משלים לגן המטרה.ישנה קבוצת מרווה פלואורסצנטית בקצה 3′ של הפלואורופור.על פי העיקרון של העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (Förster resonance energy transfer, FRET), כאשר קבוצת הפלורסנט הכתבת (מולקולת פלואורסצנטית של התורם) וקבוצת הפלורסנט המכווה (מולקולת פלואורסצנטית מקבלת) כאשר ספקטרום העירור חופף והמרחק קרוב מאוד של התורמת של הקופסה (7-10) מולקולת המקבל, בעוד האוטופלואורסצנטי נחלש.לכן, בתחילת תגובת ה-PCR, כאשר הפרוב פנוי ושלם במערכת, קבוצת הפלורסנט המדווחת לא תפלוט פלואורסצנטיות.בעת חישול, הפריימר והפרוב נקשרים לתבנית.בשלב ההארכה, הפולימראז מסנתז באופן רציף שרשראות חדשות.ל-DNA פולימראז פעילות 5'-3' exonuclease.כאשר יגיעו לבדיקה, ה-DNA פולימראז יבצע הידרוליזה של הבדיקה מהתבנית, יפריד את קבוצת הפלורסנט הכתב מקבוצת הפלורסנט המרווה וישחרר את האות הפלואורסצנטי.מאחר וקיים קשר אחד לאחד בין הבדיקה לתבנית, שיטת הבדיקה עדיפה על שיטת הצביעה מבחינת הדיוק והרגישות של הבדיקה.

איור 1 עקרון qRT-PCR

עיצוב פריימר
עקרונות:

הפריימרים צריכים להיות מתוכננים באזור השמור של סדרת חומצות הגרעין ובעלי סגוליות.

עדיף להשתמש ברצף cDNA, וגם רצף mRNA מקובל.אם לא, גלה את עיצוב אזור התקליטורים של רצף ה-DNA.
אורכו של המוצר הכמותי הפלורסנטי הוא 80-150bp, הארוך ביותר הוא 300bp, אורך הפריימר הוא בדרך כלל בין 17-25 בסיסים, וההבדל בין הפריימרים במעלה הזרם למורד הזרם לא צריך להיות גדול מדי.

תכולת G+C היא בין 40% ל-60%, ו-45-55% היא הטובה ביותר.
ערך ה-TM הוא בין 58-62 מעלות.
נסו להימנע מדימרים של פריימר ודימרים עצמיים, (לא מופיעים יותר מ-4 זוגות של בסיסים משלימים עוקבים) מבנה סיכת ראש, אם בלתי נמנע, הפוך ΔG<4.5kJ/mol* אם אינך יכול להבטיח שה-gDNA הוסר במהלך שעתוק הפוך נקי, עדיף לתכנן את הפריימרים של ה-intron *3 לא יכול להיות מודרן ו-T′C. /C, A/G מבנה רציף (2-3) פריימרים ולא-
ספציפי ההומולוגיה של הרצף המוגבר בצורה הטרוגנית היא רצוי פחות מ-70% או בעלת הומולוגיה של 8 בסיסים משלימים.
מאגר מידע:
חיפוש CottonFGD לפי מילות מפתח
עיצוב פריימר:
עיצוב פריימר IDT-qPCR

Fig2 IDT דף כלי עיצוב פריימר מקוון

תצוגת דף תוצאות איור 3
עיצוב פריימרים של lncRNA:
lncRNA:אותם שלבים כמו mRNA.
מירנה:העיקרון של שיטת ה-stem-loop: מכיוון שכל ה-miRNAs הם רצפים קצרים של כ-23 nt, לא ניתן לבצע זיהוי PCR ישיר, ולכן נעשה שימוש בכלי רצף לולאת ה-stem.רצף לולאת הגזע הוא DNA חד-גדילי של כ-50 nt, שיכול ליצור מבנה סיכת ראש בעצמו.3 'ניתן לעצב את הקצה כרצף משלים למקטע החלקי של ה-miRNA, ואז ניתן לחבר את ה-MiRNA של המטרה לרצף לולאת הגזע במהלך שעתוק הפוך, והאורך הכולל יכול להגיע ל-70bp, וזה בקנה אחד עם אורך המוצר המוגבר שנקבע על ידי qPCR.עיצוב פריימר זנבה של miRNA.
זיהוי ספציפי להגברה:
מסד נתונים מקוון לפיצוצים: פיצוץ CottonFGD לפי דמיון ברצף
פיצוץ מקומי: עיין בשימוש ב-Blast+ כדי לבצע פיצוץ מקומי, לינוקס ו-macos יכולים להקים ישירות מסד נתונים מקומי, מערכת win10 יכולה להיעשות גם לאחר התקנת ubuntu bash.צור מסד נתונים מקומי ופיצוץ מקומי;פתח את אובונטו bash ב-win10.
שים לב: כותנה על הקרקע וכותנה באי ים הם גידולים טטרפלואידים, כך שהתוצאה של הפיצוץ תהיה לרוב שתי התאמות או יותר.בעבר, שימוש בתקליטורי NAU כמסד נתונים לביצוע פיצוץ עשוי למצוא שני גנים הומולוגיים עם רק כמה הבדלים ב-SNP.בדרך כלל, לא ניתן להפריד את שני הגנים ההומולוגיים על ידי עיצוב פריימר, ולכן מתייחסים אליהם כאל זהים.אם יש אינדל ברור, הפריימר מתוכנן בדרך כלל על האינדל, אבל זה עלול להוביל למבנה המשני של הפריימר האנרגיה החופשית נעשית גבוהה יותר, מה שמוביל לירידה ביעילות ההגברה, אבל זה בלתי נמנע.

זיהוי מבנה משני פריימר:
שלבים:open oligo 7 → קלט רצף תבנית → סגור חלון משנה → שמור → אתר את הפריימר בתבנית, הקש ctrl+D כדי להגדיר את אורך הפריימר → נתח מבנים משניים שונים, כגון גוף דימריזציה עצמית, הטרודימר, סיכת ראש, אי התאמה וכו'. שתי התמונות האחרונות באיור 4 הן תוצאות הבדיקה של הפריימרים.התוצאה של הפריימר הקדמי טובה, אין מבנה דימר וסיכת ראש ברור, אין בסיסים משלימים רציפים, והערך המוחלט של האנרגיה החופשית הוא פחות מ-4.5, בעוד שהפריימר האחורי מראה מתמשך 6 הבסיסים משלימים, והאנרגיה החופשית היא 8.8;בנוסף, מופיע דימר רציני יותר בקצה 3', ומופיע דימר של 4 בסיסים רצופים.למרות שהאנרגיה החופשית אינה גבוהה, ה-3′ דימר Chl יכול להשפיע באופן רציני על ספציפיות ההגברה ויעילות ההגברה.בנוסף, יש צורך לבדוק סיכות שיער, הטרודימרים ואי התאמה.

תוצאות זיהוי Fig3 oligo7
זיהוי יעילות הגברה:
יעילות ההגברה של תגובת ה-PCR משפיעה ברצינות על תוצאות ה-PCR.גם ב-qRT-PCR, יעילות ההגברה חשובה במיוחד עבור התוצאות הכמותיות.הסר חומרים, מכונות ופרוטוקולים אחרים במאגר התגובה.לאיכות הפריימרים יש גם השפעה רבה על יעילות ההגברה של qRT-PCR.על מנת להבטיח את דיוק התוצאות, גם כימות הקרינה היחסית וגם כימות הקרינה המוחלטת צריכים לזהות את יעילות ההגברה של הפריימרים.ידוע שיעילות ההגברה האפקטיבית של qRT-PCR היא בין 85% ל-115%.ישנן שתי שיטות:
1. שיטת עקומה סטנדרטית:
א.מערבבים cDNA
ב.דילול שיפוע
c.qPCR
ד.משוואת רגרסיה לינארית לחישוב יעילות ההגברה
2. LinRegPCR
LinRegPCR היא תוכנית לניתוח של נתוני RT-PCR בזמן אמת, הנקראים גם נתוני PCR כמותיים (qPCR) המבוססים על SYBR Green או כימיה דומה.התוכנית משתמשת בנתונים שאינם מתוקנים בקו הבסיס, מבצעת תיקון קו בסיס על כל דגימה בנפרד, קובעת חלון-ללינאריות ולאחר מכן משתמשת בניתוח רגרסיה ליניארית כדי להתאים קו ישר דרך מערך הנתונים של PCR.מהשיפוע של קו זה מחושבת יעילות ה-PCR של כל דגימה בודדת.יעילות ה-PCR הממוצעת לאמפליקון וערך ה-Ct לדגימה משמשים לחישוב ריכוז התחלתי לדגימה, המבוטא ביחידות קרינה שרירותיות.קלט ופלט נתונים הם באמצעות גיליון אלקטרוני של Excel.מדגם בלבד
נדרש ערבוב, אין שיפוע
נדרשים שלבים:(קח את Bole CFX96 כדוגמה, לא ממש מכונה עם ABI ברור)
לְנַסוֹת:זהו ניסוי qPCR סטנדרטי.
פלט נתוני qPCR:LinRegPCR יכול לזהות שתי צורות של קבצי פלט: RDML או תוצאות הגברת כימות.למעשה, זהו ערך הזיהוי בזמן אמת של מספר המחזור ואות הקרינה על ידי המכונה, וההגברה מתקבלת על ידי ניתוח ערך שינוי הקרינה של יעילות המקטע הליניארי.
בחירת נתונים: בתיאוריה, ערך ה-RDML צריך להיות שמיש.ההערכה היא שהבעיה של המחשב שלי היא שהתוכנה לא יכולה לזהות RDML, אז יש לי את ערך הפלט של Excel בתור הנתונים המקוריים.מומלץ לבצע תחילה סינון גס של הנתונים כמו כשל בהוספת דגימות וכדומה. ניתן למחוק את הנקודות בנתוני הפלט (כמובן שלא ניתן למחוק אותן, LinRegPCR יתעלם מנקודות אלו בשלב מאוחר יותר)

איור 5 ייצוא נתונים qPCR

איור 6 בחירת מדגמי מועמדים

קלט נתונים:פתח את תוצאות הגברת ההסמכה.xls, → פתח את LinRegPCR → קובץ → קרא מ- Excel → בחר פרמטרים כפי שמוצג באיור 7 → אישור → לחץ על קבע קווי בסיס

איור 7 שלבים של קלט נתונים linRegPCR

תוֹצָאָה:אם אין חזרה, אין צורך בקיבוץ.אם יש חזרה, ניתן לערוך את הקיבוץ בקיבוץ המדגם, ולהזין את שם הגן במזהה, ואז אותו גן יקובץ אוטומטית.לבסוף, לחץ על הקובץ, ייצא אקסל וצפה בתוצאות.יעילות ההגברה ותוצאות R2 של כל באר יוצגו.שנית, אם תתחלק לקבוצות, תוצג יעילות ההגברה הממוצעת המתוקנת.ודא שיעילות ההגברה של כל פריימר היא בין 85% ל-115%.אם הוא גדול מדי או קטן מדי, זה אומר שיעילות ההגברה של הפריימר ירודה.

איור 8 תוצאה ופלט נתונים

תהליך ניסוי:
דרישות איכות RNA:
טוֹהַר:1.72.0 מציין שייתכן שיש שאריות איזותיוציאנט.חומצת גרעין נקיה A260/A230 צריכה להיות בסביבות 2. אם יש ספיגה חזקה ב-230 ננומטר, זה מצביע על כך שיש תרכובות אורגניות כמו יוני פנאט.בנוסף, ניתן לזהות אותו באמצעות אלקטרופורזה של 1.5% אגרוז ג'ל.הצבע על הסמן, מכיוון של-ssRNA אין דנטורציה וללוגריתם המשקל המולקולרי אין קשר ליניארי, ולא ניתן לבטא את המשקל המולקולרי בצורה נכונה.ריכוז: תיאורטיתלֹאפחות מ-100ng/ul, אם הריכוז נמוך מדי, הטוהר בדרך כלל נמוך ולא גבוה

ג'ל RNA Fig9

בנוסף, אם הדגימה יקרה וריכוז ה-RNA גבוה, מומלץ למנות אותה לאחר המיצוי, ולדלל את ה-RNA לריכוז סופי של 100-300ng/ul עבור שעתוק הפוך.בתהליך של תעתיק הפוך, כאשר ה-mRNA משועתק, primers oligo (dt) שיכולים להיקשר ספציפית לזנבות polyA משמשים לתעתוק הפוך, בעוד lncRNA ו-circRNA משתמשים בפריימרים אקראיים של hexamer (Random 6 mer) לשעתוק הפוך של סך RNA עבור miRNA, משתמשים ב-miRNA ספציפיים ל-neck-loop transcript עבור תמלול הפוך.חברות רבות השיקו כעת ערכות זנב מיוחדות.עבור שיטת לולאת הגזע, שיטת הזנב נוחה יותר, בעלת תפוקה גבוהה וחוסכת ריאגנטים, אך ההשפעה של הבחנה בין miRNAs מאותה משפחה לא צריכה להיות טובה כמו שיטת לולאת הגזע.לכל ערכת שעתוק לאחור יש דרישות לריכוז של פריימרים ספציפיים לגנים (לולאות גזע).ההתייחסות הפנימית המשמשת עבור miRNA היא U6.בתהליך של היפוך לולאת גזע, יש להפוך צינור של U6 בנפרד, ולהוסיף ישירות את הפריימרים הקדמיים והאחוריים של U6.גם circRNA וגם lncRNA יכולים להשתמש ב-HKGs כהתייחסות פנימית.בזיהוי cDNA,
אם אין בעיה עם RNA, גם cDNA אמור להיות בסדר.עם זאת, אם רודפים אחר השלמות של הניסוי, עדיף להשתמש בגן ​​התייחסות פנימי (Reference gene, RG) שיכול להבחין בין gDNA לתקליטורים.באופן כללי, RG הוא גן למשק בית., HKG) כפי שמוצג באיור 10;באותו זמן, הכנתי חלבון לאחסון פולי סויה, והשתמשתי באינטרונים המכילים אקטין 7 כהתייחסות פנימית.גודלו של הפרגמנט המוגבר של פריימר זה ב-gDNA היה 452bp, ואם נעשה שימוש ב-cDNA כתבנית, הוא היה 142bp.לאחר מכן תוצאות הבדיקה גילו שחלק מה-cDNA היה למעשה מזוהם ב-gDNA, וזה גם הוכיח שאין בעיה עם התוצאה של שעתוק הפוך, והוא יכול לשמש כתבנית ל-PCR.זה חסר תועלת להפעיל אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ישירות עם cDNA, וזו פס מפוזר, שאינו משכנע.

איור 10 זיהוי cDNA

קביעת תנאי qPCRבדרך כלל אין בעיה לפי הפרוטוקול של הערכה, בעיקר בשלב של tm value.אם חלק מהפריימרים לא מתוכננים היטב במהלך תכנון הפריימר, וכתוצאה מכך הבדל גדול בין ערך ה-tm ל-60°C התיאורטי, מומלץ שה-cDNA לאחר ערבוב הדגימות, להריץ PCR גרדיאנט עם פריימרים, ולנסות להימנע מהגדרת הטמפרטורה ללא פסים כערך ה-TM.

ניתוח נתונים

שיטת עיבוד PCR כמותית הקרינה היחסית המקובלת היא בעצם לפי 2-ΔΔCT.תבנית עיבוד נתונים.

מוצרים קשורים:

זמן אמת PCR קל^TM – תקמן

זמן אמת PCR קל^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix לסינתזת cDNA של גדיל ראשון)

RT Easy II (Master Premix לסינתזת cDNA של גדיל ראשון עבור qPCR)