COVID-19 היא מחלה זיהומית הנגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה וירוס קורונה סוג 2. כאשר אדם נדבק, התסמינים השכיחים ביותר כוללים חום, שיעול וקוצר נשימה.

ניתן לאסוף את הדגימות המשמשות לבדיקה באמצעות משטחי אף-לוע או משטחי פה-לוע.

מה זה PCR?

השיטה הסטנדרטית לגילוי קורונה היא תגובת שרשרת פולימראז, PCR.זוהי שיטה בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית.זה יכול להעתיק במהירות מיליונים למיליארדים של שברי DNA ספציפיים.

נגיף הקורונה החדש מכיל גנום RNA חד-גדילי ארוך מאוד.על מנת לזהות וירוסים אלו על ידי PCR, יש להמיר מולקולות RNA לרצפי ה-DNA המשלימים שלהם על ידי תעתיק הפוך, ולאחר מכן ניתן להגביר את ה-DNA החדש שסונתז על ידי נהלי PCR סטנדרטיים, הידועים בדרך כלל כ-RT-PCR.

תהליך RT-PCR

מיצוי RNA

כדי לבצע שיטה זו, יש בעצם לחלץ RNA ויראלי.ניתן להשתמש במגוון ערכות לטיהור RNA להפרדה נוחה, מהירה ויעילה.

כדי לחלץ RNA ויראלי באמצעות ערכה מסחרית, תחילה הוסף את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן ערבב אותה עם חיץ התמוגה.חיץ זה הינו בעל דנטורציה גבוהה ובדרך כלל מורכב מפנול וגואנידין איזותיוציאנט.בנוסף, מעכבי RNase נמצאים בדרך כלל במאגר התמוגה כדי להבטיח בידוד של RNA ויראלי שלם.

לאחר הוספת חיץ תמוגה, מערבלים את צינור הערבוב בדופק ודגירה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן נגיף הנגיף בתנאי דנטורציה גבוהים המסופקים על ידי חיץ התמוגה.

לאחר שהדגימה עוברת lysed, נעשה שימוש בצינור צנטריפוגה להליך הטיהור.הדגימה נטענת לתוך צינור הצנטריפוגה ולאחר מכן בצנטריפוגה.

הליך זה הוא שיטת מיצוי פאזה מוצקה שבה השלב הנייח מורכב ממטריצת סיליקה ג'ל.

בתנאי מלח ו-pH אופטימליים, מולקולות RNA נקשרות לממברנת הסיליקה.

במקביל, חלבון ומזהמים אחרים מוסרים.

לאחר הצנטריפוגה, הכניסו את צינור הצנטריפוגה לצינור איסוף נקי, השליכו את התסנין, ולאחר מכן הוסף חיץ כביסה.

הנח את הצינור בצנטריפוגה שוב כדי לאלץ את חיץ השטיפה דרך הממברנה.זה יסיר את כל הזיהומים הנותרים מהממברנה, וישאיר רק את ה-RNA קשור לסיליקה ג'ל.

לאחר שטיפת הדגימה, הכניסו את הצינור לצינורית מיקרוצנטריפוגה נקייה והוסיפו את חיץ הפליטה.

לאחר מכן הוא עובר צנטריפוגה כדי לאלץ את חיץ הפליטה דרך הממברנה.מאגר האלוציה מסיר RNA ויראלי מעמודת הספין ומשיג RNA מטוהר ללא חלבונים, מעכבים ומזהמים אחרים.

שלב 2

תרכיז מעורב

לאחר מיצוי ה-RNA הנגיפי, השלב הבא הוא הכנת תערובת התגובה להגברת PCR.בשלב זה משתמשים בתרכיז.תמיסה מרוכזת זו היא תמיסה מרוכזת מרוכזת מראש המורכבת מ-premix, transcriptase הפוכה, נוקלאוטידים, פריימר קדימה, פריימר הפוך, פרוב TaqMan ו-DNA פולימראז.

לבסוף, כדי להשלים את תערובת התגובה הזו, מוסיפים את תבנית ה-RNA.הצינורות מעורבבים על ידי מערבולת דופק, ולאחר מכן תערובת התגובה מועמסת לתוך צלחת PCR.צלחת PCR מכילה בדרך כלל 96 בארות ויכולה לנתח מספר דגימות בו זמנית.

שלב 3

הגברה של PCR

לאחר מכן, הנח את הצלחת במכונת ה-PCR, שהיא בעצם מחזור תרמי.

RT-PCR בזמן אמת משמש לזיהוי נגיף הקורונה החדש של 2019 על ידי הגברה של רצף המטרה בגן RdrRP, גן E וגן N.בחירת גן המטרה תלויה ברצף הפריימר והבדיקה.

השלב הראשון של RT-PCR הוא שעתוק הפוך.הגדיל הראשון של ה-DNA המשלים מסונתז, המופעל על ידי ה-PCR הפוך פריימר, הנקשר לחלק המשלים של גנום ה-RNA הנגיפי.לאחר מכן תעתיק הפוך מוסיף נוקלאוטידים של DNA לקצה ה-3 של הפריימר כדי לסנתז DNA משלים ל-RNA הנגיפי.הטמפרטורה ומשך השלב של שלב זה תלויים בפריימרים, ב-RNA היעד ובטרנסקריפטאז ההפוך בשימוש.

לאחר מכן, מיושם שלב דנטורציה ראשוני, אשר מביא לדנטורציה של ההיברידית RNA-DNA.שלב זה נחוץ כדי להפעיל את ה-DNA פולימראז.במקביל, התעתיק ההפוך מושבת.

PCR מורכב מסדרה של מחזורים תרמיים.כל מחזור מורכב משלבי דנטורציה, חישול והרחבה.

שלב הדנטורציה כולל חימום תא התגובה ל-95 מעלות צלזיוס ושימוש בו לצורך דנטורציה של תבנית ה-DNA הדו-גדילית.

בשלב הבא, טמפרטורת התגובה מופחתת ל-58 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר לפריימר הקדמי להסתגל לחלק המשלים של תבנית ה-DNA החד-גדילית שלו.טמפרטורת החישול תלויה ישירות באורך ובהרכב הפריימר.

בשלב ההרחבה, ה-DNA פולימראז מסנתז גדיל DNA חדש המשלים לגדיל תבנית ה-DNA.על ידי הוספת גרעינים חופשיים משלימים לתבנית בכיוון 5′ עד 3′ מתערובת התגובה.הטמפרטורה של שלב זה תלויה בפולימראז ה-DNA המשמש.

לאחר המחזור הראשון, מתקבל יעד DNA דו-גדילי.

לאחר מכן, היכנס למחזור השני.ה-DNA הדו-גדילי עובר דנטורציה כדי לייצר שתי מולקולות DNA חד-גדיליות.

בשלב הבא, מורידים את טמפרטורת התגובה, מפרידים את הפריימרים לכל תבנית DNA חד-גדילית, והבדיקה של Taq-man עוברת חישול לחלק המשלים של DNA המטרה.

הבדיקה של TaqMan מורכבת מפלוורופור המקושר באופן קוולנטי לקצה ה-5 של בדיקת האוליגונוקלאוטיד.כאשר הוא נרגש ממקור האור של המחזור, הפלואורופור פולט פלואורסצנטיות.בנוסף, הבדיקה מורכבת ממרווה בקצה ה-3.הקרבה של גן הכתב למרווה מונעת את זיהוי הקרינה.

בשלב ההרחבה, ה-DNA פולימראז מסנתז גדיל חדש.כאשר הפולימראז מגיע לבדיקה של TaqMan, פעילותו האנדוגנית של 5′נוקלאז מבקעת את הבדיקה, ומפרידה את הצבע מהמרווה.

עם כל מחזור של PCR, יותר מולקולות צבע משתחררות, וכתוצאה מכך עלייה בעוצמת הקרינה פרופורציונלית למספר האמפליקונים המסונתזים.

שיטה זו מאפשרת להעריך את המספר של רצף נתון הקיים במדגם.מספר שברי ה-DNA הדו-גדילי מכפיל את עצמו בכל מחזור.לכן, ניתן להשתמש ב-PCR כדי לנתח דגימות קטנות מאוד.

למדידת אות פלורסנט, מנורת הלוגן טונגסטן, מסנן עירור, רפלקטור, עדשה, מסנן פליטה ומצלמת CCD בשילוב מטען.

שלב 4 זיהוי

למדידת אות פלורסנט, מנורת הלוגן טונגסטן, מסנן עירור, רפלקטור, עדשה, מסנן פליטה ומצלמת CCD בשילוב מטען.

האור המסונן מהמנורה מוחזר על ידי הרפלקטור, עובר דרך עדשת הקבל, וממוקד למרכז כל חור.אז הקרינה הנפלטת מהחור משתקפת מהמראה, עוברת דרך מסנן הפליטה, ומזוהה על ידי מצלמת ה-CCD.בכל מחזור PCR, ניתן לזהות את האור הפלואורופור הנרגש בעצמו על ידי ה-CCD.

זה ממיר את האור שנלכד לנתונים דיגיטליים.שיטה זו נקראת PCR בזמן אמת, והיא מאפשרת ניטור בזמן אמת של התקדמות תגובת ה-PCR.