PCR, מרובות PCR, PCR באתרו, PCR הפוך, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

נמיין את המושגים, השלבים והפרטים של PCR שונים

Ⅰ. PCR

תגובת שרשרת פולימראז, המכונה PCR, היא טכנולוגיה ביולוגית מולקולרית המשמשת להגדלת שברי DNA ספציפיים.זה יכול להיחשב כשכפול DNA מיוחד במבחנה.DNA פולימראז (DNA Polymerase I) התגלה כבר בשנת 1955, ו-Klenow Fragment of E. Coli, בעל ערך ניסיוני ומעשיות, התגלה על ידי ד"ר H. Klenow בתחילת שנות ה-70, אך מכיוון שהאנזים הזה אינו סובל טמפרטורה, טמפרטורה גבוהה יכולה לדרדר אותו, ולכן הוא אינו פוגש את תגובת ניוון השרשרת בטמפרטורה גבוהה.האנזימים הנמצאים בשימוש כיום (הנקראים Taq polymerase), בודדו מ-Thermus aquaticus, חיידק מעיינות חמים בשנת 1976. המאפיין שלו הוא שהוא יכול לעמוד בפני טמפרטורות גבוהות והוא אנזים אידיאלי, אך נעשה בו שימוש נרחב לאחר שנות ה-80.הרעיון המקורי של אב הטיפוס הפרימיטיבי המקורי של PCR דומה לתיקון והעתקת גנים, שהוצע על ידי ד"ר KJell Kleppe בשנת 1971. הוא פרסם את העותק הגנים הפשוט והקצר הראשון הראשון (בדומה לשתי תגובות המחזור הראשונות של PCR).ה-PCR שפותח היום פותח על ידי ד"ר קארי ב. מוליס בשנת 1983. ד"ר מוליס שירת חברות PE באותה שנה, ולכן ל-PE יש מעמד מיוחד בתעשיית ה-PCR.ד"ר מוליס פרסם רשמית את המאמר הקשור הראשון עם Saiki ואחרים בשנת 1985. מאז, השימוש ב-PCR הוא אלפי קילומטרים ביום, וניתן לומר שהאיכות של מאמרים קשורים הופכת שיטות מחקר רבות אחרות לבלתי טעימות.לאחר מכן, טכנולוגיית PCR נמצאת בשימוש נרחב במחקר מדעי ביולוגי וביישומים קליניים, והופכת לטכנולוגיה החשובה ביותר של מחקר ביולוגיה מולקולרית.מוליס זכה גם בפרס נובל לכימיה לשנת 1993.

PCRעִקָרוֹן

העיקרון הבסיסי של טכנולוגיית PCR דומה לתהליך השכפול הטבעי של DNA, והספציפיות שלו תלויה בפריימר האוליגונוקלאוטידים המשלים לשני קצוות רצף המטרה.PCR מורכב משלושה שלבי תגובות בסיסיים של ניוון-חישול-הארכת: ניוון של תבנית DNA: לאחר שה-DNA של התבנית מחומם לכ-93 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן מסוים, תמיסת ה-DNA הכפול ל-DNA הדו-שרשרת שנוצר על ידי הגברה של ה-DNA של התבנית שיצא, הפוך אותו לשרשרת בודדת עם ה-primer הבא כדי להכין אותו לתגובת הפרימר הבאה.②החישול (תרכובת) של ה-DNA של התבנית ושל הפריימר: לאחר שה-DNA של התבנית מחומם ומתנוון לשרשרת בודדת, הטמפרטורה יורדת לכ-55°C.הרצף המשלים של הפריימר ושל התבנית DNA חד-שרשרת.③הרחבה של הפריימר: תבנית DNA-הקשירה של הפריימר מבוססת על הפעולה של TaqDNA פולימראז, עם dNTP כחומר הגלם של התגובה.שמור על עקרון השכפול, סנתז שרשרת העתקה שמורה למחצה חדשה המשלימה את שרשרת ה-DNA של התבנית, וחזור על ניוון-חישול-הרחבת מחזור שלושה תהליכים יכולים לקבל יותר "שרשרת העתקים שמורה למחצה", והשרשרת החדשה הזו זמינה שוב. הפוך לתבנית למחזור הבא.זה לוקח 2-4 דקות כדי להשלים את הלולאה, ניתן להגביר את גן המטרה כמה מיליוני פעמים תוך 2-3 שעות.

תֶקֶןPCRמערכת תגובה

חמישה אלמנטים של תגובת PCR

ישנם בעיקר חמישה סוגים של חומרים המעורבים בתגובת PCR, כלומר פריימר, אנזים, dNTP, תבנית ומאגר (נדרש Mg2+).[הליך PCR]

תהליך ה-PCR הסטנדרטי מחולק לשלושה שלבים

1. ניוון DNA (90°C-96°C): תבניות DNA דו-שרשרת תחת פעולה תרמית, קשרי מימן נשברים ויוצרים DNA בעל שרשרת אחת.

2. חישול (25℃ -65℃): טמפרטורת המערכת מופחתת, הפריימר משולב עם תבנית ה-DNA ליצירת שרשרת כפולה מקומית.

3. הרחבה (70℃ -75℃): תחת פעולת אנזים Taq (בערך 72°C, הפעילות הטובה ביותר), dNTP משמש כחומר הגלם, משתרע מקצה 5′ של הפריימר → 3′ קצה, סינתזה ותבנית משלימות זו את שרשרת ה-DNA.

כל מחזור עובר דנטורציה, חישול ומורחב, מה שמכפיל את תכולת ה-DNA.כיום, בשל אזור ההגברה הקצר, ניתן לשכפל חלק מה-PCR בזמן קצר מאוד גם אם פעילות האנזים Taq אינה מיטבית, ולכן ניתן לשנותו לשני שלבים, כלומר, ניתן לבצע את החישול והארכה ב-60°C-65°C בו זמנית.על מנת להפחית את תהליך ההרמה והקירור ולשפר את מהירות התגובה.

תכונות תגובת PCR

● מפרט גבוה

הגורמים המכריעים הספציפיים של תגובת ה-PCR הם: ①השילוב הספציפי של הפריימר וה-DNA התבנית.②עקרון זיווג הבסיס.③הנאמנות של תגובת סינתזה של TaqDNA פולימראז.④הספציפיות והשמרנות של גן המטרה.

השילוב הנכון של פריימרים ותבניות הוא המפתח.הקישור של הפריימר והתבנית והארכת שרשרת הפריימר מבוססים על העיקרון של התאמת בסיס אלקליין.ניתן לבצע בטמפרטורה גבוהה יותר את הנאמנות של תגובות סינתזה של פולימראז ועמידות הטמפרטורה הגבוהה של פולימראז ה-Taq DNA ליצירת הקישור (התרכובת) של התבנית והפריימר בתגובה.הספציפיות של השילוב גדלה מאוד.הקליפ יכול לשמור על דרגת נכונות גבוהה.על ידי בחירת אזור יעד גנטי עם שמרנות גבוהה ושמרנות גבוהה, הספציפיות שלו גבוהה יותר.

● רגישות גבוהה

נפח הייצור של מוצרי PCR גדל לפי אינדקס, מה שיכול להרחיב את תבנית ההתחלה של Picker (PG=10-12) כדי להעלות את רמת המיקרו-בקר לרמת המיקרוגרם (μg= -6).ניתן לזהות תאי מטרה ממיליון תאים;בזיהוי וירוסים, הרגישות של PCR יכולה להגיע ל-3 RFUs (נקודות ריקות שנוצרו יחידות);שיעור הזיהוי המינימלי במדעי החיידקים הוא 3 חיידקים.

● פשוט ומהיר

השתקפות ה-PCR משתמשת בפולימראז של Taq DNA בטמפרטורה גבוהה, המוסיף את תמיסת התגובה בבת אחת, כלומר, תגובת ניוון-חישול-הרחבת תמיסת הגברה של DNA וסיר אמבט מים.בדרך כלל, תגובת ההגברה מסתיימת תוך 2 עד 4 שעות.מוצרים מוגדלים מנותחים בדרך כלל על ידי חרב חשמלית, ואינם חייבים להשתמש באיזוטופים, ללא זיהום רדיואקטיבי וקידום קל.

● טוהר הדגימה נמוך

אין צורך להפריד בין וירוסים או חיידקים ותאי תרבית.ניתן להשתמש במוצרים גולמיים של DNA ו-RNA כמגברים.ניתן להשתמש בזיהוי הגברה של DNA ישירות באמצעות דגימות קליניות כגון דם, נוזל גוף, נוזל שטיפת שיעול, שיער, תאים ורקמות חיות.

PCRבעיות נפוצות

● False negative, ללא פסים מוגברים

שלבי המפתח של תגובת ה-PCR כוללים: ① הכנת חומצות גרעין תבניתיות, ② איכות וסגוליות של פריימרים, ③ איכות האנזימים ④ תנאי מחזור PCR.יש לנתח ולחקור את מציאת הסיבה גם עבור הקישורים לעיל.

תבניות: ① התבנית מכילה חלבון שונות, ② התבנית מכילה מעכב אנזים Taq, ③ החלבון בתבנית אינו מסולק, במיוחד החלבון הקבוצתי בכרומוזום.⑤ ניוון חומצת הגרעין דמינר אינו יסודי.כאשר איכות האנזימים והפריימרים טובה, אין רצועת הגברה, שהיא ככל הנראה טיפול עיכול בדגימות.יש משהו לא בסדר בתהליך מיצוי חומצת גרעין תבנית, ולכן כדי להכין תמיסת עיכול יעילה ויציבה, יש לתקן את הנוהל שלו ולא לשנות באופן שרירותי.

השבתת אנזים: יש להשתמש באנזים חדש או בשני אנזימים ישנים וחדשים יחד כדי לנתח אם פעילות האנזים אבדה או לא מספקת, מה שמוביל לשלילי שווא.יש לציין שלעיתים שוכחים אנזים Taq או אתידיום ברומיד.

פריימר: איכות הפריימר, ריכוז הפריימר והאם ריכוז שני הפריימרים סימטרי.זוהי סיבה נפוצה לכישלון ה-PCR או שהפס הגובר אינו אידיאלי ונוטה להתפזר.יש בעיות עם איכות הפריימרים של מספרי אצווה מסוימים.לשני הפריימרים ריכוז גבוה וריכוז נמוך, מה שגורם להגברה א-סימטרית ביעילות נמוכה.אמצעי הנגד הם: ① בחר פריימר טוב לסינתזה של יחידות.② ריכוז הפריימר לא תלוי רק בערך ה-OD, אלא גם שם לב לנוזל המקורי של הפריימר כדי ליצור אלקטרופורזה של ג'ל סוכר אגר.חייב להיות אזור רצועת פריימר, והבהירות של שני הפריימרים צריכה להיות עקבית באופן כללי.חגורה, PCR עלול להיכשל בשלב זה, ויש לפתור זאת באמצעות יחידת סינתזת הפריימר.אם פריימר גבוה, הבהירות נמוכה, ויש לאזן את ריכוזו בדילול.③ יש לשלם את הפריימר ולאחסן אותו בריכוז גבוה כדי למנוע הקפאה מרובת או חלקי קירור לטווח ארוך של המקרר, מה שיגרום להתקלקלות של הפריימר ולהתכלות.④ העיצוב של הפריימר אינו סביר, כגון אורך הפריימר אינו מספיק, וה-di cluster נוצר בין הפריימרים.

ריכוז Mg2+: לריכוז Mg2+יון יש השפעה רבה על יעילות הגברה של PCR.ריכוז מוגזם יכול להפחית את המין השני של הגברה של PCR.אם הריכוז נמוך מדי, פלט הגברה של PCR אפילו יגרום לכשל בהגברת PCR ללא פס ההרחבה.

שינוי נפח התגובה: הנפח המשמש בהגברת PCR הוא 20ul, 30ul ו-50ul או 100uL, הנפח הגדול של הבקשה להגברת PCR נקבע בהתאם למטרות שונות של מחקר מדעי ובדיקות קליניות.לאחר ביצוע נפחים קטנים כגון 20ul, יש צורך לעשות תנאי כבל בעת ביצוע הגודל, אחרת זה ייכשל.

סיבות פיזיות: טרנספורמציה חשובה מאוד להגברת PCR.אם טמפרטורת הניוון נמוכה, זמן הניוון קצר, סביר להניח שהיא תתרחש בתשלילים כוזבים;טמפרטורת חישול נמוכה מדי יכולה לגרום להגברה לא ספציפית ולהפחית את יעילות ההגברה הספציפית.משפיע מאוד על השילוב של פריימרים ותבניות כדי להפחית את יעילות הגברה של PCR.לפעמים יש צורך להשתמש במדחום סטנדרטי כדי לזהות את השונות, החישול והטמפרטורה המורחבת בסיר הארכה או המסיס במים, וזו אחת הסיבות לכשל ב-PCR.

וריאנטים של רצף המטרה: אם מתרחש רצף המטרה, מוטציה או מחיקה, השילוב של אב הטיפוס והתבנית משולב, או בגלל היעדר רצף מטרה, הפריימר והתבנית יאבדו את הרצף המשלים, והגברת ה-PCR שלו לא תצליח.

● חיובי כוזב

פס ההגברה של PCR נראה עקבי עם פס רצף המטרה, ולפעמים הרצועה שלו מסודרת וגבוהה יותר.

עיצוב פריימר אינו מתאים: רצף ההגברה שנבחר ורצף ההגברה הלא-תכליתי הם הומולוגיים, כך שכאשר הגברה של PCR, תוצרי ה-PCR המוגברים הם רצפים לא-תכליתיים.רצף המטרה קצר מדי או הפריימר קצר מדי, והוא נוטה ל-false positive.צריך לעצב מחדש.

זיהום צולב של רצף מטרה או תוצרי הגברה: ישנן שתי סיבות לזיהום זה: ראשית, זיהום צולב של הגנום כולו או מקטעים גדולים, המוביל לתוצאות חיוביות שגויות.ניתן לפתור סוג זה של חיובי כוזב בשיטות הבאות: היזהר ועדין במהלך הפעולה כדי למנוע משאיפת רצף המטרה לאקדח הדגימה או להתיז החוצה מהצינור הצנטריפוגלי.למעט אנזימים וחומרים שאינם יכולים לעמוד בטמפרטורות גבוהות, יש לחטא את כל הריאגנטים או הציוד בלחץ גבוה.יש להשתמש בצינורות ובדגימות הצנטריפוגליות בבת אחת.בעת הצורך, לפני הוספת דגימות, צינור התגובה והריאגנט נחשפים לקרניים אולטרה סגולות כדי להרוס את חומצת הגרעין הקיימת.שנית, שברים קטנים בזיהום האוויר.השברים הקטנים האלה קצרים יותר מרצף המטרה, אבל יש להם הומולוגיה מסוימת.ניתן לחבר זה עם זה.לאחר השלמת הפריימרים, ניתן להרחיב את תוצר ה-PCR, מה שיגרום לייצור חיובי שגוי.ניתן להשתמש בו כדי להפחית או לבטל את שיטת הקן PCR.

● להופיע פס הגברה לא ספציפי

הרצועות שהופיעו לאחר הגברה של PCR אינן עולות בקנה אחד עם הגודל הצפוי, או גדולות או קטנות, או בו-זמנית, או באותו הזמן, פסי הגברה ספציפיים ורצועות הגברה לא ספציפיות.הופעתן של להקות לא ספציפיות היא: ראשית, הפריימרים אינם שלמים משלימים לרצף היעד, או פילמור של הפריימר ליצירת די צביר.השני הוא שריכוז יוני MG2+ גבוה מדי, טמפרטורת החישול נמוכה מדי, ומספר מחזורי ה-PCR קשור.שנית, איכות וכמות האנזימים.לעתים קרובות, אנזימים של מקורות מסוימים נוטים להקות לא מיוחדות והאנזימים של המקור השני אינם מתרחשים.לפעמים מתרחשת גם הגברה לא ספציפית של אנזימים.אמצעי הנגד הם: עיצוב מחדש של אטרקטיביות במידת הצורך.הפחת את כמות האנזים או החלף את האנזים ממקור אחר.הקטינו את כמות התבניות הראשוניות, הגדילו את כמות התבניות כראוי והקטינו את מספר המחזורים.הגדל כראוי את טמפרטורת החישול או השתמש בשיטת שתי נקודות הטמפרטורות (93°C ניוון, חישול והארכה בכ-65°C).

● נראה גרר מתקלף או סרט מריחה

לעתים נראה שהגברת PCR מוחל או מופגז או חגורה דמוית שטיח.מהסיבה, בגלל כמות האנזימים המוגזמת או האיכות הירודה של האנזים, ריכוז dNTP גבוה מדי, ריכוז Mg2+ גבוה מדי, טמפרטורת החישול נמוכה מדי ומספר המחזורים גדול מדי.אמצעי הנגד הם: ①הפחת את כמות האנזימים, או שנה את האנזים של מקור אחר.②הפחת את הריכוז של dNTP ③הפחת כראוי את ריכוז Mg2+.④הגדל את כמות התבניות והפחת את מספר המחזורים.

מוצרים קשורים

PCR Heroᵀᴹ (עם צבע)

◮ נאמנות גבוהה יותר: פי 6 מאנזים Taq רגיל;

◮ מהירות הגברה מהירה יותר

◮ יותר התאמה של תבניות

◮ יעילות הגברה גבוהה יותר

◮ סובלנות סביבתית חזקה יותר: ממוקם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבוע, תוך שמירה על יותר מ-90% פעילות;

◮ יש לו פעילות 5'→3' DNA פולימראז ופעילות 5'→3' exonuclease, ללא פעילות 3'→5' exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (עם צבע)

מערכת התגובה הייחודית וה-Taq DNA Polymerase ביעילות גבוהה גורמים לתגובת PCR להיות בעלת יעילות הגברה, סגוליות ורגישות גבוהות יותר.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (צעד אחד)-SYBR Green I

◮ ערכה חד-שלבית הופכת לתעתוק הפוך ו-qPCR שתי תגובות באותה צינור, רק צריך להוסיף RNA תבנית, פריימרים ספציפיים ל-PCR ו- RNase-Free ddH₂O.

◮ הערכה יכולה לנתח במהירות וביעילות RNA ויראלי כמותי או להתחקות אחר RNA.

◮ הערכה משתמשת במגיב ייחודי לשעתוק הפוך של Foregene וב-Foregene HotStar Taq DNA Polymerase בשילוב עם מערכת תגובה ייחודית כדי לשפר ביעילות את יעילות ההגברה והספציפיות של התגובה.

◮ מערכת התגובה האופטימלית גורמת לתגובה רגישות זיהוי גבוהה יותר, יציבות תרמית חזקה יותר וסובלנות טובה יותר.

◮ RT-qPCR קל^TMערכת (One Step)-SYBR Green I מגיעה עם צבע התייחסות פנימי ROX, שניתן להשתמש בו כדי לחסל רקע אות ושגיאות איתות בין בארות, מה שנוח לשימוש ללקוחות בדגמים שונים של מכשירי PCR כמותיים.

RT קל^TMII (Master Premix עבור סינתזת cDNA של גדיל ראשון עבורPCR בזמן אמת)

-יכולת יעילה להסרת gDNA, שיכולה להסיר gDNA בתבנית תוך 2 דקות.

-מערכת שעתוק לאחור יעילה, לוקח רק 15 דקות להשלים את הסינתזה של cDNA הגדיל הראשון.

-תבניות מורכבות: ניתן גם להפוך תבניות עם תוכן GC גבוה ומבנה משני מורכב ביעילות גבוהה.

-מערכת שעתוק לאחור ברגישות גבוהה, תבניות ברמת pg יכולות גם לקבל cDNA באיכות גבוהה.

-למערכת השעתוק ההפוך יש יציבות תרמית גבוהה, טמפרטורת התגובה האופטימלית היא 42 ℃, ועדיין יש לה ביצועי שעתוק הפוך טובים ב 50 ℃.