PCR היא טכנולוגיית ההגברה הנפוצה ביותר של חומצות גרעין ונמצאת בשימוש נרחב בשל הרגישות והספציפיות שלה.עם זאת, PCR דורש דנטורציה תרמית חוזרת ואינו יכול להיפטר מהמגבלות של הסתמכות על מכשירים וציוד, מה שמגביל את היישום שלו בבדיקות שטח קליניות.

מאז תחילת שנות ה-90, מעבדות רבות החלו לפתח טכנולוגיית הגברה טמפרטורה קבועה שאינה מצריכה דנטורציה תרמית.כעת הם פיתחו טכנולוגיית הגברה איזותרמית בתיווך לולאה, טכנולוגיית הגברה איזותרמית להחלפת גדילים, טכנולוגיית הגברה איזותרמית במעגל מתגלגל ותלות ברצף חומצות גרעין.טכנולוגיית הגברה איזותרמית וטכנולוגיות נוספות. 

Lהגברה איזותרמית בתיווך oop

עקרון ההגברה מבוסס על העובדה שה-DNA נמצא במצב שיווי משקל דינמי בכ-65 מעלות צלזיוס.כאשר פריימר כלשהו מותאם לבסיסים ומתרחב לחלק המשלים של DNA דו-גדילי, הגדיל השני יתנתק ויהפוך ליחיד-גדילי.

בטמפרטורה זו, ה-DNA משתמש ב-4 פריימרים ספציפיים כדי להסתמך על פולימראז DNA של עקירת גדילים כדי לגרום לסינתזה של DNA עקירת גדילים להסתובב באופן רציף.

תחילה קבע את 6 האזורים הספציפיים F3, F2, F1, B1, B2, B3 בגן היעד, ולאחר מכן תכנן 4 פריימרים המבוססים על 6 האזורים הספציפיים הללו (כמתואר באיור למטה):

הפריימר הפנימי הקדמי (FIP) מורכב מ-F1c ו-F2.

הפריימר הפנימי לאחור (BIP) מורכב מ-B1c ו-B2, ו-TTTT משמש כמרווח באמצע.

הפריימרים החיצוניים F3 ו-B3 מורכבים בהתאמה מאזורי F3 ו-B3 בגן המטרה.

במערכת התגובה LAMP, ריכוז הפריימר הפנימי הוא פי כמה מזה של הפריימר החיצוני.הפריימר הפנימי משולב תחילה עם גדיל התבנית כדי לסנתז גדיל משלים ליצירת גדיל DNA כפול.לאחר מכן, הפריימר החיצוני משולב עם גדיל התבנית ליצירת גדיל DNA כפול.תחת הפעולה של BstDNA פולימראז, הגדיל המשלים המסונתז על ידי הפריימר הפנימי משתחרר.לאחר סדרה של תגובות, הגדיל המשלים יוצר לבסוף גדיל DNA יחיד עם מבנה משקולת.

גדיל ה-DNA של מבנה המשקולת עצמו משמש כתבנית ליצירת דנ"א של מבנה לולאת גזע מעברי עם קצה פתוח.הפריימרים הפנימיים והחיצוניים מנחים את ה-DNA של מבנה לולאת גזע המעבר לעבור ללא הרף תגובות תזוזה והארכת גדילים, ולבסוף יוצרים מבני לולאת גזע מרובים באורכים שונים.תערובת DNA.

יתרונות וחסרונות של הגברה איזותרמית בתיווך לולאה

יתרונות מנורה:

(1) יעילות הגברה גבוהה, שיכולה להגביר ביעילות 1-10 עותקים של גן המטרה תוך שעה, ויעילות ההגברה היא פי 10-100 מזו של PCR רגיל.

(2) זמן התגובה קצר, הספציפיות חזקה, ואין צורך בציוד מיוחד.

חסרונות של LAMP:

(1) הדרישות לפריימרים גבוהות במיוחד.

(2) לא ניתן להשתמש במוצר המוגבר לצורך שיבוט ורצף, אלא ניתן להשתמש בו רק לשיפוט.

(3) בשל רגישותו החזקה, קל ליצור אירוסולים, מה שגורם לתוצאות שגויות ומשפיע על תוצאות הבדיקה.

Sהגברה של עקירת טרנד

הגברה של עקירת גדיל (SDA) היא טכניקת הגברה איזותרמית של DNA במבחנה המבוססת על תגובה אנזימטית שהוצעה לראשונה על ידי החוקר האמריקאי ווקר ב-1992.

המערכת הבסיסית של SDA כוללת אנדונוקלאז הגבלה, פולימראז DNA עם פעילות עקירת גדילים, שני זוגות של פריימרים, dNTPs, ויוני סידן ומגנזיום ומערכות חיץ.

העיקרון של הגברה של עקירת גדילים מבוסס על רצף זיהוי האנדונוקלאז של הגבלה שהשתנה כימית בשני קצוות ה-DNA של המטרה.האנדונוקלאז פותח את הפער ב-DNA הגדיל באתר הזיהוי שלו, וה-DNA פולימראז מאריך את הפער 3′ End ומחליף את גדיל ה-DNA הבא.

ניתן לשלב את הגדילים הבודדים של ה-DNA עם פריימרים ולהרחיב אותם לגדילים כפולים על ידי DNA פולימראז.תהליך זה חוזר על עצמו ברציפות, כך שרצף המטרה מוגבר ביעילות.

יתרונות וחסרונות של טכנולוגיית הגברה של עקירת גדילים

היתרונות של SDA:

יעילות ההגברה גבוהה, זמן התגובה קצר, הספציפיות חזקה, ואין צורך בציוד מיוחד.

חסרונות של SDA:

המוצרים אינם אחידים, וחלק ממוצרים חד-גדילים וכפולים מיוצרים תמיד במחזור ה-SDA, והזנב יתרחש בהכרח כאשר יתגלה באלקטרופורזה.

Rהגברה של מעגל olling

הגברה של מעגל מתגלגל (RCA) מוצע על ידי ציור על השיטה של ​​העתקת DNA מאורגניזמים פתוגניים על ידי מעגל גלגול.זה מתייחס לשימוש ב-DNA מעגלי חד-גדילי כתבנית בטמפרטורה קבועה, וב-DNA פולימראז מיוחד (כגון Phi29) ) תחת פעולת סינתזת ה-DNA במעגל מתגלגל כדי להשיג את ההגברה של גן המטרה.

ניתן לחלק את ה-RCA להגברה לינארית ולהגברה אקספוננציאלית.היעילות של RCA ליניארי יכולה להגיע ל-10⁵פעמים, והיעילות של RCA אקספוננציאלית יכולה להגיע ל-10⁹פִּי.

הבחנה פשוטה, כפי שמוצג באיור למטה, הגברה ליניארית a משתמשת רק ב-primer אחד, להגברה אקספוננציאלית b יש 2 פריימרים.

RCA ליניארי נקרא גם RCA פריימר יחיד.פריימר נקשר ל-DNA מעגלי ומתארך על ידי פעולת ה-DNA פולימראז.המוצר הוא גדיל בודד ליניארי עם מספר רב של רצפים שחוזרים על עצמם פי אלפי אורך של לולאה בודדת.

מכיוון שהתוצר של RCA ליניארי מחובר תמיד לפריימר ההתחלתי, הקיבוע הקל של האות הוא יתרון מרכזי.

RCA אקספוננציאלי, הידוע גם כ-Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), ב-RCA אקספוננציאלי, פריימר אחד מגביר את תוצר ה-RCA, הפריימר השני משתלב עם תוצר ה-RCA ומתרחב, וההחלפה כבר קשורה למוצר ה-RCA. הפריימרים במורד הזרם מאריכים את הגדיל, וחוזרים על הארכה והחלפה של ampl ליצירת תוצר דדריפיקציה.

היתרונות והחסרונות של הגברה של חומצת גרעין מתגלגלת

היתרונות של RCA:

רגישות גבוהה, ספציפיות טובה ותפעול קל.

חסרונות של RCA:

בעיות רקע במהלך זיהוי האות.במהלך תגובת ה-RCA, בדיקת המנעול הבלתי-מוזרה וה-DNA או ה-RNA של התבנית של הבדיקה הלא קשורה עשויים ליצור כמה אותות רקע. 

Nהגברה מבוססת רצף ucleicacid

הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין (NASBA) היא טכנולוגיה חדשה שפותחה על בסיס PCR.זהו הגברה מתמשכת ואיזותרמית של חומצת גרעין המונחה על ידי זוג פריימרים עם רצף פרומטור T7.הטכנולוגיה יכולה להגביר את תבנית ה-RNA בכ-109 פעמים תוך כשעתיים, שהוא פי 1000 גבוה משיטת ה-PCR המקובלת ואינו דורש ציוד מיוחד.

טכנולוגיה זו שימשה לאבחון מהיר של מחלות מיד עם הופעתה, וחברות רבות משתמשות כיום בשיטה זו בערכות זיהוי RNA.

למרות שהגברת RNA יכולה להשתמש גם בטכנולוגיית PCR של שעתוק הפוך, ל-NASBA יש יתרונות משלה: היא יכולה להתבצע בתנאי טמפרטורה קבועים יחסית, והיא יציבה ומדויקת יותר מטכנולוגיית PCR מסורתית.

התגובה היא ב-41 מעלות צלזיוס ודורשת AMV (נגיף מיאלובלסטוזיס עופות) טרנסקריפטאז הפוך, RNase H, T7 RNA פולימראז וזוג פריימרים כדי להשלים.

התהליך כולל בעיקר:

הפריימר קדימה מכיל את הרצף המשלים של פרומוטור T7.במהלך התגובה, הפריימר הקדמי נקשר לגדיל ה-RNA ומזרז על ידי האנזים AMV ליצירת גדיל DNA-RNA כפול.

RNase H מעכל את ה-RNA בגדיל הכפול ההיברידי ושומר על ה-DNA החד-גדילי.

תחת פעולת הפריימר ההפוך והאנזים AMV, נוצר גדיל DNA כפול המכיל את רצף פרומוטור T7.

תחת פעולתו של T7 RNA פולימראז, תהליך השעתוק הושלם ומופקת כמות גדולה של RNA מטרה.

היתרונות של NASBA:

(1) לפריימר שלו יש רצף פרומטור T7, אך ל-DNA הדו-גדילי הזר אין רצף פרומטור T7 ואינו ניתן להגברה, ולכן לטכנולוגיה זו יש ספציפיות ורגישות גבוהה.

(2) NASBA משלבת ישירות את תהליך השעתוק ההפוך בתגובת ההגברה, ומקצרת את זמן התגובה.

החסרונות של NASBA:

(1) מרכיבי התגובה מורכבים יותר.

(2) נדרשים שלושה סוגים של אנזימים כדי להעלות את עלות התגובה.