Real Time PCR, המכונה גם PCR כמותי או qPCR, היא שיטה לניטור וניתוח בזמן אמת של מוצרי הגברה של PCR.
מכיוון של-PCR כמותי יש את היתרונות של פעולה פשוטה, מהירה ונוחה, רגישות גבוהה, חזרה טובה ושיעור זיהום נמוך, הוא נמצא בשימוש נרחב בבדיקות רפואיות, הערכת יעילות תרופות, מחקר ביטוי גנים, מחקר טרנסגני, זיהוי גנים, זיהוי פתוגנים, זיהוי בעלי חיים וצמחים., בדיקות מזון ותחומים אחרים.
לכן, בין אם אתם עוסקים במחקר בסיסי במדעי החיים, או עובדים של חברות תרופות, חברות גידול בעלי חיים, חברות מזון, או אפילו עובדים בלשכות פיקוח והסגר בכניסה-יציאה, מחלקות ניטור סביבתי, בתי חולים ויחידות אחרות, תוכלו להיחשף פחות או יותר או שאתם צריכים לדעת את הידע בשליטה ב-PCR כמותי.

עקרון של PCR בזמן אמת

Real Time PCR היא שיטה שבה מוסיפים חומרים פלואורסצנטיים למערכת תגובת PCR, ועוצמת אות הקרינה בתהליך תגובת PCR מנוטרת בזמן אמת על ידי מכשיר PCR כמותי, ולבסוף מנתחים ומעובדים את נתוני הניסוי.

【עקומת הגברה】היא העקומה המתארת ​​את התהליך הדינמי של PCR.עקומת ההגברה של PCR אינה למעשה עקומה מעריכית סטנדרטית, אלא עקומת סיגמואידית.

[שלב הפלטפורמה של עקומת ההגברה]עם העלייה במספר מחזורי ה-PCR, השבתת ה-DNA פולימראז, דלדול ה-dNTPs והפריימרים, ועיכוב תגובת הסינתזה על ידי pyrophosphate תוצר התגובה וכו', ה-PCR לא תמיד מתרחב באופן אקספוננציאלי., ובסופו של דבר ייכנס לרמה.

[אזור צמיחה אקספוננציאלי של עקומת הגברה]למרות ששלב הרמה משתנה מאוד, באזור מסוים של אזור הצמיחה האקספוננציאלי של עקומת ההגברה, החזרה טובה מאוד, וזה חשוב מאוד לניתוח כמותי של PCR.

[ערך סף וערך Ct]קבענו את ערך הגבול של זיהוי הקרינה במיקום המתאים באזור הצמיחה האקספוננציאלי של עקומת ההגברה, כלומר ערך הסף (Threshold).המפגש בין ערך הסף ועקומת ההגברה הוא ערך Ct, כלומר ערך Ct מתייחס למספר המחזורים (Threshold Cycle) כאשר ערך הסף מושג.

הגרף שלהלן מציג בבירור את הקשר בין קו הסף לעקומת ההגברה, הסף וערך ה-Ct.

【איך לכמת?】

הוכח על ידי תיאוריה מתמטית שלערך Ct יש קשר ליניארי הפוך עם הלוגריתם של מספר התבניות הראשוניות.Real Time PCR מנטר מוצרי הגברה PCR בזמן אמת ומכמת אותם בשלב ההגברה האקספוננציאלית.

עבור כל מחזור של PCR, ה-DNA גדל באופן אקספוננציאלי פי 2, ועד מהרה הגיע למישור.

בהנחה שכמות ה-DNA ההתחלתי היא A₀ , לאחר n מחזורים, ניתן לבטא את הכמות התיאורטית של תוצר ה-DNA כך:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

לאחר מכן, ככל שכמות ה-DNA הראשונית A 0 גדולה יותר, כך כמות התוצר המוגבר תגיע מוקדם יותר לערך הזיהוי An, ומספר המחזורים כאשר מגיעים ל-An הוא ערך Ct.כלומר, ככל שכמות ה-DNA ההתחלתית A 0 גדולה יותר, כך עקומת ההגברה מגיעה לשיא מוקדם יותר, ובהתאמה מספר המחזורים הנדרש n קטן יותר.

אנו מבצעים דילול גרדיאנט של תקן הריכוז הידוע ומשתמשים בו כתבנית ל-Real Time PCR, ותתקבל סדרה של עקומות הגברה במרווחים שווים בסדר כמות ה-DNA ההתחלתית מיותר לפחות.לפי הקשר הליניארי בין ערך Ct ללוגריתם של מספר התבניות ההתחלתיות, אניתן ליצור [עקומה סטנדרטית] .

על ידי החלפת ערך Ct של הדגימה בריכוז לא ידוע בעקומה הסטנדרטית, ניתן לקבל את כמות התבנית הראשונית של הדגימה בריכוז לא ידוע, שהוא העיקרון הכמותי של PCR בזמן אמת.

שיטת זיהוי של PCR בזמן אמת

Real Time PCR מזהה תוצרי הגברה של PCR על ידי זיהוי עוצמת הקרינה במערכת התגובה.

עקרון שיטת הטבעת צבע פלואורסצנטי】

צבעים פלורסנטים, כגון TB Green ® , יכול להיקשר באופן לא ספציפי ל-DNA דו-גדילי במערכות PCR ולהאיר עם הקישור.

עוצמת הקרינה במערכת התגובה עלתה באופן אקספוננציאלי עם עליית מחזורי ה-PCR.על ידי זיהוי עוצמת הקרינה, ניתן לעקוב אחר כמות הגברה של ה-DNA במערכת התגובה בזמן אמת, ולאחר מכן ניתן להעריך הפוך את כמות התבנית ההתחלתית בדגימה.

【עקרון של שיטת בדיקה פלורסנטית】

בדיקה פלורסנטיתהוא רצף חומצות גרעין עם קבוצה פלואורסצנטית בקצה 5' וקבוצת מרווה בקצה 3', שיכולה להיקשר ספציפית לתבנית.כאשר הגשושית שלמה, הקרינה הנפלטת מהפלואורופור נכבית על ידי הקבוצה המכווה ואינה יכולה להאיר.כאשר הבדיקה מתפרקת, החומר הפלורסנטי יתפרק ויפלוט פלואורסצנטיות.

בדיקה פלורסנטית מתווספת לתמיסת תגובת PCR.במהלך תהליך החישול, הבדיקה הפלורסנטית תיקשר למיקום הספציפי של התבנית.במהלך תהליך ההרחבה, פעילות האקסונוקלאז 5′→3′ של האנזים PCR יכולה לפרק את הבדיקה הפלורסנטית שהכלאה עם התבנית, והחומר הפלורסנטי מנותק כדי לפלוט פלואורסצנטיות.על ידי זיהוי עוצמת הקרינה של הבדיקה במערכת התגובה, ניתן להשיג את מטרת הניטור של כמות ההגברה של תוצר ה-PCR.

【בחירת שיטת זיהוי הקרינה】

אם משתמשים בו כדי להבחין בין רצפים בעלי הומולוגיה גבוהה ולבצע זיהוי PCR מרובי כמו ניתוח SNP הקלדה, שיטת הבדיקה הפלורסנטית היא שאין לה תחליף.
עבור ניסויי PCR אחרים בזמן אמת, ניתן להשתמש בשיטת כימרה פלורסנט פשוטה, קלה ובעלות נמוכה.

בדיקות ספציפיות חזקה, מסוגלת לריבוי PCR

חִסָרוֹן

דרישות ספציפיות גבוהות להגברה;

לא ניתן לבצע multiplex PCR צריך לתכנן בדיקות ספציפיות, עלות גבוהה;

לפעמים עיצוב בדיקה קשה

מוצרים קשורים: