ערך Ct הוא צורת הצגת התוצאה החשובה ביותר של PCR כמותי פלואורסצנטי.הוא משמש לחישוב הבדלי ביטוי גנים או מספר העתק גנים.אז מהו ערך ה-Ct של כימות הקרינה הנחשב סביר?כיצד להבטיח את הטווח האפקטיבי של ערך Ct?

מהו ערך Ct?
במהלך תהליך ההגברה של qPCR, המספר המקביל של מחזורי ההגברה (Cycle Threshold) כאשר אות הקרינה של המוצר המוגבר מגיע לסף הקרינה שנקבע.C מייצג מחזור ו-T מייצג Threshold.במילים פשוטות, ערך ה-Ct הוא מספר המחזורים המתאים למועד שבו ההגברה הראשונית של התבנית מגיעה לכמות מסוימת של מוצר ב-qPCR.מה שנקרא "כמות מסוימת של מוצר" יוסבר בהמשך.

מה עושה ערך Ct?

1. הקשר בין הגברה אקספוננציאלית, כמות התבנית וערך Ct
באופן אידיאלי, גנים ב-qPCR מצטברים על ידי הגברה אקספוננציאלית לאחר מספר מסוים של מחזורים.הקשר בין מספר מחזורי ההגברה לכמות המוצרים הוא: כמות מוצר מוגבר = כמות תבנית ראשונית × (1+En) מספר מחזורים.עם זאת, תגובת qPCR לא תמיד במצב אידיאלי.כאשר כמות התוצר המוגבר מגיעה ל"כמות מוצר מסוימת", מספר המחזורים בזמן זה הוא ערך Ct, והוא נמצא בתקופת ההגברה האקספוננציאלית.הקשר בין ערך Ct לכמות התבנית ההתחלתית: קיים קשר ליניארי בין ערך Ct של התבנית ללוגריתם של מספר העותק ההתחלתי של התבנית.ככל שריכוז התבנית הראשוני גבוה יותר, כך ערך Ct קטן יותר;ככל שריכוז התבנית הראשוני נמוך יותר, כך ערך Ct גדול יותר.

2. עקומת הגברה, סף הקרינה וכמות מוצר PCR מסוימת
כמות תוצר ההגברה של qPCR מוצגת ישירות בצורה של אות ניאון, כלומר, עקומת ההגברה.בשלב מוקדם של PCR ההגברה היא בתנאים אידיאליים, מספר המחזורים קטן, הצטברות המוצר קטנה, ולא ניתן להבחין בבירור בין רמת הקרינה לבין רקע הקרינה.לאחר מכן, הקרינה עולה ונכנסת לשלב האקספוננציאלי.ניתן לזהות את כמות תוצר ה-PCR בנקודה מסוימת כאשר תגובת ה-PCR נמצאת רק בשלב האקספוננציאלי, אשר יכול לשמש כ"כמות מסוימת של תוצר", ומכאן ניתן להסיק את התוכן הראשוני של התבנית.לכן, עוצמת אות הקרינה התואמת לכמות מסוימת של מוצר היא סף הקרינה.

בשלב המאוחר של ה-PCR, עקומת ההגברה אינה מציגה עוד הגברה אקספוננציאלית, ונכנסת לשלב הליניארי ולשלב הרמה.

3. שחזור של ערכי Ct
כאשר מחזור ה-PCR מגיע למספר המחזור של ערך Ct, הוא פשוט נכנס לתקופת ההגברה האקספוננציאלית האמיתית.בשלב זה, השגיאה הקטנה לא הוגברה, ולכן יכולת השחזור של ערך Ct מצוינת, כלומר, אותה תבנית מוגברת בזמנים שונים או בצינורות שונים בו-זמנית.הגברה, ערך ה-Ct המתקבל הוא קבוע.

1. יעילות הגברה En
יעילות הגברה של PCR מתייחסת ליעילות שבה הפולימראז ממיר את הגן להגברה לאמפליקון.יעילות ההגברה כאשר מולקולת DNA אחת הופכת לשתי מולקולות DNA היא 100%.יעילות הגברה מתבטאת בדרך כלל כ-En.על מנת להקל על הניתוח של המאמרים הבאים, מוצגים בקצרה הגורמים המשפיעים על יעילות ההגברה.

2. טווח ערכי Ct
ערכי Ct נעים בין 15-35.אם ערך ה-Ct נמוך מ-15, נחשב שההגברה נמצאת בטווח של תקופת הבסיס ולא הושג סף הקרינה.באופן אידיאלי, יש קשר ליניארי בין ערך Ct ללוגריתם של מספר ההעתקה הראשוני של התבנית, כלומר, העקומה הסטנדרטית.דרך העקומה הסטנדרטית, כאשר יעילות ההגברה היא 100%, ערך ה-Ct המחושב לכימות מספר העותק הבודד של הגן הוא סביב 35. אם הוא גדול מ-35, מספר העותק הראשוני של התבנית הוא תיאורטית פחות מ-1, מה שיכול להיחשב חסר משמעות.

עבור טווחי Ct גנים שונים, עקב ההבדל במספר העתקות הגנים ויעילות ההגברה בכמות התבנית הראשונית, יש צורך לעשות עקומה סטנדרטית לגן ולחשב את טווח הגילוי הליניארי של הגן.

3. גורמים משפיעים של ערך Ct
מהקשר בין מספר מחזורי ההגברה לכמות התוצר: כמות התוצר המוגבר = כמות התבנית הראשונית × (1+En) מספר מחזור, ניתן לראות שבתנאים אידיאליים, לכמות התבנית הראשונית וה-En תהיה השפעה שלילית על ערך Ct.ההבדל באיכות התבנית או ביעילות ההגברה יגרום לערך Ct להיות גדול מדי או קטן מדי.

ערך 4.Ct גדול מדי או קטן מדי