טכנולוגיית האבחון המולקולרית משתמשת בשיטות ביולוגיה מולקולרית לאיתור הביטוי והמבנה של החומר הגנטי של גוף האדם ושל פתוגנים שונים, על מנת להשיג את המטרה של ניבוי ואבחון מחלות.

בשנים האחרונות, עם השדרוג והאיטרציה של טכנולוגיית האבחון המולקולרית, היישום הקליני של האבחון המולקולרי נעשה נרחב ומעמיק יותר ויותר, ושוק האבחון המולקולרי נכנס לתקופה של התפתחות מהירה.

המחבר מסכם את טכנולוגיות האבחון המולקולריות הנפוצות בשוק, ומחולק לשלושה חלקים: החלק הראשון מציג את טכנולוגיית ה-PCR, החלק השני מציג את טכנולוגיית ההגברה האיזותרמית של חומצת גרעין, והחלק השני מציג את טכנולוגיית הרצף.

01

חלק א': טכנולוגיית PCR

טכנולוגיית PCR

PCR (תגובת שרשרת פולימראז) היא אחת מטכנולוגיות הגברה של DNA במבחנה, עם היסטוריה של יותר מ-30 שנה.

טכנולוגיית PCR נוצרה ב-1983 על ידי קארי מוליס מ-Cetus, ארה"ב.Mullis הגיש בקשה לפטנט PCR ב-1985 ופרסם את המאמר האקדמי הראשון של PCR על מדע באותה שנה.מוליס זכה בפרס נובל לכימיה ב-1993.

עקרונות בסיסיים של PCR

PCR יכול להגביר את קטעי ה-DNA של המטרה ביותר ממיליון פעמים.העיקרון הוא שתחת קטליזה של DNA פולימראז, ה-DNA של גדיל האב משמש כתבנית, ופריימר ספציפי משמש כנקודת המוצא להארכה.הוא משוכפל במבחנה באמצעות שלבים כגון דנטורציה, חישול והרחבה.תהליך ה-DNA של גדיל הבת המשלים ל-DNA של תבנית גדיל האב.

תהליך ה-PCR הסטנדרטי מחולק לשלושה שלבים:

1. דנטורציה: השתמש בטמפרטורה גבוהה כדי להפריד גדילי DNA כפולים.קשרי המימן בין גדילי DNA כפולים נשברים בטמפרטורות גבוהות (93-98 מעלות צלזיוס).

2. חישול: לאחר הפרדת ה-DNA הדו-גדילי, הטמפרטורה יורדת כך שהפריימר יוכל להיקשר ל-DNA החד-גדילי.

3. הארכה: ה-DNA פולימראז מתחיל לסנתז גדילים משלימים לאורך גדילי ה-DNA מהפריימרים הקשורים כאשר הטמפרטורה יורדת.כאשר ההרחבה מסתיימת, מסתיים מחזור, ומספר שברי ה-DNA מוכפל.

בהדדיות שלושת השלבים הללו 25-35 פעמים, מספר שברי ה-DNA יגדל באופן אקספוננציאלי.

כושר ההמצאה של PCR הוא שניתן לעצב פריימרים שונים עבור גני מטרה שונים, כך שניתן להגביר את שברי גן המטרה בפרק זמן קצר.

עד כה, ניתן לחלק את ה-PCR לשלוש קטגוריות, כלומר PCR רגיל, PCR כמותי פלואורסצנטי ו-PCR דיגיטלי.

הדור הראשון של PCR רגיל

השתמש במכשיר הגברה רגיל של PCR כדי להגביר את גן המטרה, ולאחר מכן השתמש באלקטרופורזה של ג'ל agarose כדי לזהות את המוצר, ניתן לבצע רק ניתוח איכותי.

החסרונות העיקריים של הדור הראשון של PCR:

-נוטה להגברה לא ספציפית ולתוצאות חיוביות שגויות.

-הגילוי אורך זמן רב והפעולה מסורבלת.

-ניתן לבצע רק בדיקות איכותיות.

PCR כמותי מהדור השני של הקרינה

PCR כמותי פלואורסצנטי (Real-Time PCR), הידוע גם בשם qPCR, משמש לניטור הצטברות של מוצרים מוגברים באמצעות הצטברות של אותות ניאון על ידי הוספת בדיקות פלואורסצנטיות שיכולות להצביע על התקדמות מערכת התגובה, ולשפוט את התוצאות באמצעות עקומת הקרינה, וניתן לכמת אותה בעזרת ערך עקומת סטנדרטי.

מכיוון שטכנולוגיית ה-qPCR מתבצעת במערכת סגורה, ההסתברות לזיהום מצטמצמת, וניתן לנטר את אות הקרינה לזיהוי כמותי, כך שהיא הרווחת ביותר בפרקטיקה הקלינית והפכה לטכנולוגיה הדומיננטית ב-PCR.

ניתן לחלק את החומרים הפלורסנטים המשמשים ב-PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת: בדיקות פלורסנט של TaqMan, משואות מולקולריות וצבעים פלורסנטים.

1) בדיקה פלורסנטית של TaqMan:

במהלך הגברה של PCR, מתווספת בדיקה פלורסנטית ספציפית תוך הוספת זוג פריימרים.הבדיקה היא אוליגונוקלאוטיד, ושני הקצוות מסומנים בהתאמה עם קבוצת פלואורסצנטי כתב וקבוצת ניאון מרווה.

כאשר הגשושית שלמה, האות הפלורסצנטי הנפלט על ידי קבוצת הכתבים נספג על ידי הקבוצה המכווה;במהלך הגברה של PCR, פעילות האקסונוקלאז 5'-3' של אנזים Taq מבקעת ומפרקת את הגשש, מה שהופך את קבוצת הדיווח הפלואורסצנטית והמרווה. קבוצת הפלורסנט מופרדת, כך שמערכת ניטור הקרינה יכולה לקבל את אות הקרינה, כלומר, בכל פעם שגדיל ה-DNA מצטבר, גדילת ה-DNA מצטברת פלואורסצנטית. אות cence מסונכרן לחלוטין עם היווצרות המוצר PCR.

2) צבעי פלורסנט SYBR:

במערכת התגובה PCR, מוסיפים עודף של צבע ניאון SYBR.לאחר שצבע הפלורסנט SYBR משולב בצורה לא ספציפית ב-DNA הכפול, הוא פולט אות ניאון.מולקולת הצבע SYBR שאינה משולבת בשרשרת לא תפלוט שום אות פלואורסצנטי, ובכך תבטיח את האות הפלורסנטי העלייה במוצרי PCR מסונכרנת לחלוטין עם העלייה במוצרי PCR.SYBR נקשר רק ל-DNA דו-גדילי, כך שניתן להשתמש בעקומת ההיתוך כדי לקבוע אם תגובת ה-PCR היא ספציפית.

3) משואות מולקולריות

זהו בדיקת אוליגונוקלאוטידים עם תווית כפולה של גזע היוצר מבנה סיכת ראש של כ-8 בסיסים בקצוות 5 ו-3.רצפי חומצות הגרעין בשני הקצוות מזווגים באופן משלים, מה שגורם לקבוצת הפלורסנט ולקבוצת המרווה להיות הדוקים.סגור, זה לא יפיק פלואורסצנטיות.

לאחר יצירת תוצר ה-PCR, במהלך תהליך החישול, החלק האמצעי של המשואה המולקולרית מזווג לרצף DNA ספציפי, והגן הפלורסנטי מופרד מהגן המרווה כדי לייצר פלואורסצנטיות.

החסרונות העיקריים של הדור השני של PCR:

הרגישות עדיין חסרה, והזיהוי של דגימות בעותק נמוך אינו מדויק.

יש השפעה של ערכי רקע, והתוצאה חשופה להפרעות.

דור שלישי של PCR דיגיטלי

PCR דיגיטלי (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) מחשב את מספר ההעתקים של רצף היעד באמצעות זיהוי נקודת קצה, ויכול לבצע זיהוי כמותי מוחלט ללא שימוש בבקרות פנימיות ובעקומות סטנדרטיות.

PCR דיגיטלי משתמש בזיהוי נקודת קצה ואינו תלוי בערך ה-Ct (סף מחזור), כך שתגובת ה-PCR הדיגיטלית מושפעת פחות מיעילות ההגברה, והסבילות למעכבי תגובת PCR משתפרת, עם דיוק ושחזור גבוהים.

בשל המאפיינים של רגישות גבוהה ודיוק גבוה, הוא אינו מתערב בקלות על ידי מעכבי תגובת PCR, והוא יכול להשיג כימות מוחלט אמיתי ללא מוצרים סטנדרטיים, שהפך למוקד מחקר ויישום.

על פי הצורות השונות של יחידת התגובה, ניתן לחלק אותה לשלושה סוגים: מערכות מיקרופלואידיות, שבבים וטיפות.