PCR ישיר היא תגובה המשתמשת ישירות ברקמות של בעלי חיים או צמחים להגברה ללא מיצוי חומצת גרעין.במובנים רבים, PCR ישיר עובד כמו PCR רגיל

ההבדל העיקרי הוא המאגר המותאם אישית המשמש ב-PCR ישיר, הדגימה יכולה להיות נתונה ישירות לתגובת PCR ללא מיצוי חומצת גרעין, אך קיימות דרישות תואמות לסובלנות של האנזימים ולתאימות של המאגר המעורב בתגובת PCR הישירה.

למרות שקיימים פחות או יותר מעכבי PCR בדגימות הנפוצות, PCR ישיר עדיין יכול להשיג הגברה אמינה תחת פעולת אנזימים ובאצ'רים.תגובת PCR המסורתית דורשת חומצת גרעין איכותית כתבנית, שיכולה לעכב את התקדמות חלקה של תגובת PCR אם התבנית מכילה חלבונים וזיהומים אחרים.ישיר PCR היא כיום אחת הטכנולוגיות הפופולריות יותר בתחום האבחון המולקולרי.

01 Direct PCR שימש במקור עבור בעלי חיים וצמחים

היישום המוקדם ביותר של PCR ישיר הוא בתחום של בעלי חיים וצמחים, כגון הדם, הרקמה והשיער של החולדה, החתול, התרנגולת, הארנבת, הכבשה, הבקר וכו', עלים וזרעים של צמחים וכו', המשמשים לחקר גנוטיפ, טרנסגני, זיהוי פלסמיד, ניתוח נוק-אאוט של גנים, זיהוי מקורות DNA, זיהוי שדה ניתוח מינים וזיהוי אחרים, SNP.

לשדות אלו יש כמה תכונות משותפות, כלומר, תכולת גן המטרה גבוהה יחסית ומיצוי חומצת גרעין מטריד, כך ש-PCR ישיר יכול לא רק לחסוך זמן ולהשפיע מעט על התוצאות, אלא גם לחסוך בעלויות.

PCR ישיר המשמש לזיהוי פתוגנים הוא עניין של השנים האחרונות, כמה יצרני ריאגנטים PCR עשו מאמצים רבים בכיוון זה בעת יצירת חדשנות.במיוחד במגיפת COVID-19 זו, מוצרי זיהוי רבים כאלה הופיעו בשוק, כגון SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) שנחקרה ופותחה על ידי Foregene, המשתמשת בטכנולוגיית RT PCR בזמן אמת (rRT-PCR) לזיהוי איכותני של SARS-CoVynge-Nucleopharge-2 או חומצה אנושית. ס.

Foregene היא אחת החברות המשתמשות בטכנולוגיית Direct PCR, לזיהוי של ORF1ab, N, E ו-גִרְסָה אַחֶרֶת שושלת חומצות גרעין בדגימות ספוגיות של אף-לוע או אף-לוע אנושיות, כגון שושלת SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), שושלת B.1.351 (ZA), שושלת B.1.617 (IND) ו-P.1 שושלת (BR).

02  ריאגנטים הדרושים ל-PCR ישיר

דגימת Lysate

ניתן להגדיר את ה-lysate לדוגמא בעצמך או לרכוש.ההבדל בהרכב של מותגים שונים של ליזאט יהפוך את יכולת הליזה לשונה, ואז זמן הליזה יהיה שונה במקצת.לדוגמה, להכנת דגימות רקמה של בעלי חיים, מומלץ בדרך כלל תמוגה של 30 דקות או לילה, ותמיסת התמוגה עבור וירוסים נעה בין 3-10 דקות.

תמהיל מאסטר PCR

מומלץ להשתמש ב-DNA פולימראז עם התחלה חמה כדי לשפר הגברה ספציפית ולהגביר את יכולת ההגברה.הליבה של PCR ישיר היא פולימראז בעל סובלנות גבוהה.

לחסל או לעכב רכיבים בדגימה המשפיעים על הגברה של DNA

לאחר עיבוד הדגימה עם הליזאט, ישוחררו חלבונים, שומנים ושאר פסולת תאים, חומרים אלו יעכבו את תגובת ה-PCR.לכן, PCR ישיר דורש תוספת של הסרה או מעכבים מתאימים כדי להפחית את השפעתם של גורמים אלה.

03  אוסף של חמש נקודות ידע של PCR ישיר

ראשית, טכנולוגיית Direct PCR היא טכנולוגיית PCR ישירה לדגימות ביולוגיות שונות.במצב טכני זה, אין צורך להפריד ולחלץ את חומצת הגרעין, להשתמש ישירות בדגימת הרקמה כאובייקט, ולהוסיף את הפריימרים של גן המטרה שיבצעו את תגובת ה-PCR.

שנית, טכנולוגיית Direct PCR היא לא רק טכנולוגיית הגברה מסורתית של תבנית DNA, אלא כוללת גם PCR לשעתוק הפוך של תבנית RNA.

שלישית, טכנולוגיית Direct PCR לא רק מבצעת ישירות תגובות PCR איכותיות שגרתיות על דגימות רקמה, אלא כוללת גם תגובות qPCR בזמן אמת, המחייבות את מערכת התגובה בעלת יכולת חזקה של הפרעות קרינה אנטי רקע וקרינה אנדוגנית מרווה את היכולת האנטגוניסטית.

רביעית, הדגימות הממוקדות בטכנולוגיית Direct PCR זקוקות רק לשחרור של תבניות חומצות גרעין, ואינן מסירות חלבונים, פוליסכרידים, יוני מלחים וכו' המפריעים לתגובת ה-PCR.מה שמחייב את חומצת הגרעין פולימראז ו-PCR Mix במערכת התגובה להיות בעלי עמידות מצוינת ויכולת הסתגלות להבטחת פעילות האנזים ודיוק שכפול בתנאים מורכבים.

חמישית, דגימת הרקמה ממוקדת בטכנולוגיית Direct PCR ללא כל טיפול העשרת חומצות גרעין וכמות התבנית קטנה מאוד, מה שדורש ממערכת התגובה רגישות ויעילות הגברה גבוהים במיוחד.