בסיס עיצוב פריימר (ניתן לפתור בעיות של 99%)
1. אורך פריימר: ספר הלימוד דורש 15-30bp, בדרך כלל כ-20bp.המצב בפועל עדיף להיות 18-24bp כדי להבטיח את הספציפיות, אבל ככל שהפריימר יהיה ארוך יותר טוב יותר וארוך מדי גם יפחית את הספציפיות ויקטין את התשואה.
2. טווח הגברה של פריימר: 200-500bp מתאים, וניתן להרחיב את הפרגמנט ל-10kb בתנאים ספציפיים.
3. בסיס פריימר: התוכן של G+C צריך להיות 40-60%, מעט מדי אפקט הגברה של G+C אינו טוב, יותר מדי G+C קל להופיע להקות לא ספציפיות.ATGC מופץ בצורה אקראית בצורה הטובה ביותר, תוך הימנעות מאשכולות של יותר מ-5 נוקלאוטידים של פורין או פירמידין.Multi-gc לקצה 5' ורצפי ביניים להגברת היציבות, הימנעו מ-GC עשיר בקצה 3', ללא GC עבור 3 הבסיסים האחרונים, או ללא GC עבור 3 מתוך 5 הבסיסים האחרונים.
4. הימנע ממבנה משני בפריימרים, והימנע מהשלמה בין שני פריימרים, במיוחד השלמה בקצה ה-3, אחרת יווצר דימר פריימר ויווצרו פסים מוגברים לא ספציפיים.
5. יש לשייך את הבסיסים בקצה ה-3 של הפריימרים, במיוחד הבסיסים האחרונים והלפני אחרון, כדי למנוע כשל ב-PCR עקב בסיסים טרמינליים לא מזווגים.
6. לפריימרים יש או ניתן להוסיף אתרי ביקוע מתאימים, ורצוי לרצף היעד המוגבר להיות אתרי ביקוע מתאימים, מה שמועיל מאוד לניתוח ביקוע או שיבוט מולקולרי.
7. ספציפיות של פריימרים: לפריימרים לא צריך להיות הומולוגיה ברורה עם רצפים אחרים במסד הנתונים של רצפי חומצות הגרעין.
8. למדו להשתמש בתוכנה: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (העיצוב המקוון הזה עובד הכי טוב).
התוכן לעיל יכול לפתור לפחות 99% מבעיות עיצוב הפריימר.
שליטה על הפרטים של עיצוב פריימר
1. אורך פריימר
אורך הפריימר הכללי הוא 18~30 בסיסים.באופן כללי, הגורם החשוב ביותר הקובע את טמפרטורת החישול של הפריימר הוא אורך הפריימר.טמפרטורת החישול של הפריימר נבחרת בדרך כלל (ערך Tm -5℃), וחלקם משתמשים ישירות בערך Tm.ניתן להשתמש בנוסחאות הבאות כדי לחשב גס את טמפרטורת החישול של פריימרים.
כאשר אורך הפריימר קטן מ-20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
כאשר אורך הפריימר גדול מ-20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/אורך-5℃
בנוסף, ניתן להשתמש בתוכנות רבות גם לחישוב טמפרטורת החישול, עקרון החישוב יהיה שונה, כך שלעיתים עשוי להיות פער קטן בערך המחושב.כדי לייעל את תגובות PCR, נעשה שימוש בפריימרים הקצרים ביותר המבטיחים טמפרטורות חישול של לא פחות מ-54℃ עבור היעילות והספציפיות הטובה ביותר.
בסך הכל, סגוליות הפריימר עולה בפקטור של ארבע עבור כל נוקלאוטיד נוסף, כך שאורך הפריימר המינימלי עבור רוב היישומים הוא 18 נוקלאוטידים.הגבול העליון של אורך הפריימר אינו חשוב במיוחד, קשור בעיקר ליעילות התגובה.בגלל האנטרופיה, ככל שהפריימר ארוך יותר, כך הקצב שבו הוא מתפתל כדי להיקשר ל-DNA היעד כדי ליצור תבנית דו-גדילית יציבה ל-DNA-פולימראז להיקשר.
בעת שימוש בתוכנה לעיצוב פריימרים, ניתן לקבוע את אורך הפריימרים לפי ערך ה-TM בתורו, במיוחד עבור פריימרים של PCR כמותי הקרינה, יש לשלוט ב-TM=60℃ או כך.
2. תוכן GC
בדרך כלל, התוכן של G+C ברצפי פריימר הוא 40%~60%, ויש לתאם את תוכן GC וערך Tm של זוג פריימרים.אם לפריימר יש נטייה רצינית ל-GC או AT, ניתן להוסיף כמות מתאימה של זנב A, T או G ו-C לקצה 5' של הפריימר.
3. טמפרטורת חישול
טמפרטורת החישול צריכה להיות נמוכה ב-5℃ מטמפרטורת ביטול השרשרת.אם מספר בסיסי הפריימר קטן, ניתן להעלות את טמפרטורת החישול בצורה מתאימה, מה שיכול להגביר את הספציפיות של PCR.אם מספר הבסיסים גדול, ניתן להפחית את טמפרטורת החישול כראוי.הפרש טמפרטורת החישול בין זוג פריימרים של 4℃ ~ 6℃ לא ישפיע על תפוקת ה-PCR, אך באופן אידיאלי טמפרטורת החישול של זוג פריימרים זהה, שיכולה להשתנות בין 55℃ ~ 75℃.
4. הימנע מאזור המבנה המשני של תבנית ההגברה
עדיף להימנע מאזור המבנה המשני של התבנית בעת בחירת המקטע המוגבר.ניתן לחזות ולהעריך את המבנה המשני היציב של קטע המטרה על ידי תוכנת מחשב רלוונטית, מה שמועיל לבחירת תבנית.תוצאות ניסוי מראות שלעתים קרובות ההתפשטות אינה מוצלחת כאשר האנרגיה החופשית (△G) של האזור להרחבה היא פחות מ-58.6lkJ/mol.
5. אי התאמה ל-DNA מטרה
כאשר רצף ה-DNA המוגבר של המטרה גדול, פריימר עשוי להיקשר לחלקים מרובים של ה-DNA של המטרה, וכתוצאה מכך יופיעו רצועות מרובות בתוצאה.הפעם יש צורך להשתמש בבדיקת תוכנת BLAST, אתר:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.בחר יישר שני רצפים (bl2seq).
הדבקת רצפי פריימר לאזור 1 ורצפי DNA מטרה לאזור 2 ניתנת להחלפה, ו-BLAST מחשב אפשרויות משלימות, אנטי-סנס ואפשרויות אחרות, כך שהמשתמשים לא צריכים לשים לב אם שתי השרשראות הן שרשראות חישה.אתה יכול גם להזין את מספר ה-GI אם אתה יודע את מספר ה-GI של הרצף במסד הנתונים, כך שלא תצטרך להדביק חלק גדול מהרצף.לבסוף, לחץ על Align ב-3 כדי לראות אם לפריימר יש אתרים הומולוגיים מרובים ב-DNA היעד.
6. מסוף פריימר
קצה ה-3 של הפריימר הוא המקום שבו מתחילה ההרחבה, ולכן חשוב למנוע חוסר התאמה להתחיל שם.סוף 3' לא צריך להיות יותר מ-3 G או C עוקבים, מכיוון שזה יגרום להפעלת הפריימר בטעות באזור רצף ההעשרה של G+C.קצה ה-3 אינו יכול ליצור שום מבנה משני, למעט תגובות PCR מיוחדות (AS-PCR), לא ניתן להתאים את קצה ה-3' של הפריימר.לדוגמה, אם האזור המקודד מוגבר, אין להפסיק את 3 'סוף הפריימר במיקום השלישי של הקודון, מכיוון שהמיקום השלישי של הקודון נוטה להתנוון, מה שישפיע על הספציפיות והיעילות של ההגברה.בעת שימוש בפריימרים של סיפוח, עיין בטבלת השימוש בקודון, שימו לב להעדפה ביולוגית, אין להשתמש בפריימרים של סיפוח בקצה 3' והשתמש בריכוז גבוה יותר של פריימרים (1uM-3uM).
7. מבנה משני של פריימרים
הפריימרים עצמם לא צריכים להיות בעלי רצפים משלימים, אחרת הפריימרים עצמם יתקפלו למבנים סיכות ראש, ומבנה משני זה ישפיע על הקישור של פריימרים ותבניות עקב הפרעה סטרית.אם נעשה שימוש בשיפוט מלאכותי, הבסיסים המשלימים הרציפים של הפריימרים עצמם לא צריכים להיות גדולים מ-3bp.לא צריכה להיות השלמה בין שני הפריימרים, במיוחד יש להימנע מהחפיפה המשלימה של קצה ה-3 כדי למנוע היווצרות של דימרי פריימר.באופן כללי, לא צריך להיות יותר מ-4 בסיסים רצופים הומולוגיה או השלמה בין זוג פריימרים.
8. הוסף סמנים או לוקוסים
לקצה 5 יש השפעה מועטה על סגוליות ההגברה ולכן ניתן לשנות אותו מבלי להשפיע על סגוליות ההגברה.השינוי של primer 5'end כלל: הוספת אתר הגבלת אנזים;ביוטין מסומן, פלואורסצנטי, דיגוקסין, Eu3+ וכו'. הציגו רצפי DNA קושרי חלבונים;החדרת אתרי מוטציה, הכנסת וחסר רצפי מוטציות והכנסת רצפי פרומטור וכו'. הבסיסים הנוספים ישפיעו פחות או יותר על יעילות ההגברה ויגדילו את הסיכוי להיווצרות פריימר דימר, אך יש לעשות כמה ויתורים לקראת השלב הבא.ניתן להוסיף רצפים נוספים שאינם קיימים ברצף המטרה, כגון אתרי הגבלה ורצפי פרומטור, לקצה 5' של הפריימר מבלי להשפיע על הספציפיות.רצפים אלו אינם נכללים בחישוב ערכי ה-primer Tm, אך יש לבדוק את המשלימות ומבנה משני פנימי.
9. תת-שיבוטים
לרוב, PCR הוא שיבוט ראשוני בלבד, ואז עלינו לשכפל את קטע המטרה לוקטורים שונים, ולכן עלינו לתכנן בסיסים נוספים לפעולה הבאה בשלב ה-PCR.
כמה רצפים המיועדים לשיבוט משנה מסוכמים להלן.
אתר הגבלת אנדונוקלאז של הגבלה נוסף
הוספת אתרי הגבלת אנזים היא השיטה הנפוצה ביותר עבור תת שיבוט מוצרי PCR.בדרך כלל, אתר המחשוף הוא שישה בסיסים, בנוסף לקצה 5' של אתר המחשוף צריך להוסיף 2 ~ 3 בסיסים מגן.עם זאת, מספר בסיסי ההגנה הנדרשים על ידי אנזימים שונים שונה.לדוגמה, SalⅠ לא דורש בסיס מגן, EcoRⅤ דורש בסיס מגן אחד, NotⅠ דורש 2 בסיסי הגנה, וה-Hind Ⅲ דורש 3 בסיסי הגנה.
LIC מוסיף את הזנב
השם המלא של LIC הוא Ligation-Independent cloning, שיטת שיבוט שהומצאה על ידי Navogen במיוחד עבור חלקה בוקטור pET.לנשא pET שהוכן בשיטת LIC יש קצוות דביקים 12-15 בסיס לא משלימים, המשלימים את הקצוות הדביקים המקבילים על שבר ההכנסה של המטרה.למטרות הגברה, רצף ה-primer 5′ של הפרגמנט המוכנס צריך להשלים את וקטור LIC.פעילות החוץ של 3′→5′ של T4 DNA פולימראז יכולה ליצור קצה דביק של גדיל בודד על המקטע המוחדר לאחר זמן קצר.מכיוון שהמוצר יכול להיווצר רק מחישול הדדי של קטע ה-insert המוכן והווקטור, שיטה זו מהירה ויעילה מאוד, והיא שיבוט מכוון.
שיבוט TA מכוון להוסיף זנב
שיבוט TA לא היה מסוגל לכוון את הפרגמנט לוקטור, אז מאוחר יותר Invitrogen הציג וקטור שיכול היה לכוון לשיבוט, שהכיל ארבעה GTGGS בסיסיים בולטים בקצה אחד.לכן, בתכנון של primers PCR, יש להוסיף רצפים משלימים בהתאם, כך שניתן יהיה "לכוון את המקטעים".
אם אתה קצר בזמן, אתה יכול לנסות סינתזה ישירה, לשלב את הגן עם הווקטור, שזה מה שאנו מכנים סינתזת גן ET אצל רופאים.
ד.שיטת שיבוט In-Fusion
לא נדרש ליגאז, אין צורך בתגובה ארוכה.כל עוד מכניסים רצף בשני הקצוות של הווקטור הליניארי בתכנון של פריימרים, אז תוצר ה-PCR והווקטור הליניארי מתווספים לתמיסת האנזים בפיוז'ן המכילה BSA ומניחים בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה, ניתן לבצע את הטרנספורמציה.שיטה זו מתאימה במיוחד להמרת נפח גדול.
10. מיזוג פריימר
לפעמים, רק מידע רצף מוגבל ידוע על עיצוב פריימר.לדוגמה, אם ידוע רק רצף חומצות האמינו, ניתן לעצב את הפריימר המתמזג.פריימר מיזוג הוא תערובת של רצפים שונים המייצגים את כל אפשרויות הבסיס השונות המקודדות לחומצת אמינו אחת.כדי להגביר את הספציפיות, אתה יכול להתייחס לטבלת השימוש בקודונים כדי להפחית את הסיפוח בהתאם להעדפות השימוש הבסיסיות של אורגניזמים שונים.ניתן לזווג היפוקסנטין עם כל הבסיסים כדי להפחית את טמפרטורת החישול של הפריימר.אין להשתמש בבסיסים המצורפים בקצה 3' של הפריימר מכיוון שהחישול של 3 הבסיסים האחרונים בקצה 3' מספיקה כדי להתחיל PCR באתר הלא נכון.ריכוזי פריימר גבוהים יותר (1μM עד 3μM) משמשים מכיוון שפריימרים בתערובות סיפוח רבות אינם ספציפיים לתבנית היעד.
חומרי גלם PCRלִשְׁלוֹט
1. כמות פריימר
הריכוז של כל פריימר הוא 0.1 ~ 1umol או 10 ~ 100pmol.עדיף להפיק את התוצאה הנדרשת עם כמות הפריימר הנמוכה ביותר.ריכוז גבוה של פריימר יגרום לחוסר התאמה והגברה לא ספציפית, ויגדיל את הסיכוי ליצירת דימרים בין פריימרים.
2. ריכוז פריימר
ריכוז הפריימרים משפיע על הספציפיות.ריכוז הפריימר האופטימלי הוא בדרך כלל בין 0.1 ל-0.5μM.ריכוזי פריימר גבוהים יותר מובילים להגברה של מוצרים לא ספציפיים.
3. טמפרטורת חישול של פריימר
פרמטר חשוב נוסף עבור פריימרים הוא טמפרטורת ההיתוך (Tm).זוהי הטמפרטורה שבה 50% מהפריימרים והרצפים המשלימים מיוצגים כמולקולות DNA דו-גדיליות.Tm נדרש כדי להגדיר את טמפרטורת חישול PCR.באופן אידיאלי, טמפרטורת החישול נמוכה מספיק כדי להבטיח חישול יעיל של הפריימרים עם רצף המטרה, אך גבוהה מספיק כדי להפחית קישור לא ספציפי.טמפרטורת חישול סבירה בין 55 ℃ ל 70 ℃.טמפרטורת החישול מוגדרת בדרך כלל 5℃ נמוכה מ-Tm של פריימר.
ישנן מספר נוסחאות לקביעת Tm, אשר משתנות מאוד בהתאם לנוסחה המשמשת ולרצף הפריימרים.מכיוון שרוב הנוסחאות מספקות ערך Tm משוער, כל טמפרטורות החישול הן רק נקודת התחלה.ניתן לשפר את הספציפיות על ידי ניתוח מספר תגובות המעלות בהדרגה את טמפרטורת החישול.התחל מתחת ל-Tm-5℃ המשוער, והגדל בהדרגה את טמפרטורת החישול בתוספת של 2℃.טמפרטורת חישול גבוהה יותר תפחית את היווצרותם של דימרי פריימר ומוצרים לא ספציפיים.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לשני הפריימרים צריכים להיות ערכי Tm משוערים.אם הפרש ה-Tm של זוגות הפריימרים הוא יותר מ-5℃, הפריימרים יציגו התחלה שגויה משמעותית על ידי שימוש בטמפרטורת חישול נמוכה יותר במחזור.אם שני הפריימרים Tm שונים, הגדר את טמפרטורת החישול ל-5℃ נמוכה מה-Tm הנמוך ביותר.לחלופין, כדי להגביר את הספציפיות, ניתן לבצע תחילה חמישה מחזורים בטמפרטורות חישול המיועדות ל-Tm גבוה יותר, ולאחר מכן את המחזורים הנותרים בטמפרטורות חישול המיועדות ל-Tm נמוכות יותר.זה מאפשר לקבל עותק חלקי של תבנית היעד בתנאים צפופים.
4. פריימר טוהר ויציבות
הטוהר הסטנדרטי של פריימרים מותאמים אישית מתאים לרוב יישומי PCR.ההסרה של קבוצות בנזואיל ואיזובוטיליל על ידי הסרת מלח היא מינימלית ולכן אינה מפריעה ל-PCR.יישומים מסוימים דורשים טיהור כדי להסיר רצפים שאינם באורך מלא בתהליך הסינתזה.רצפים קטועים אלה מתרחשים מכיוון שהיעילות של כימיה של סינתזת DNA אינה 100%.זהו תהליך מעגלי המשתמש בתגובות כימיות חוזרות ונשנות כאשר כל בסיס מתווסף ליצירת DNA מ-3′ עד 5′.אתה יכול להיכשל בכל מחזור.לפריימרים ארוכים יותר, במיוחד אלה הגדולים מ-50 בסיסים, יש חלק גדול של רצפים קטומים ועשויים לדרוש טיהור.
תפוקת הפריימרים מושפעת מהיעילות של כימיה סינתטית ושיטת טיהור.חברות ביו-פרמצבטיקה, כמו ציטולוגיה ושנגונג, כולן משתמשות ביחידת OD מינימלית כדי להבטיח את התפוקה הכוללת של אוליגונוקלאוזיד.פריימרים מותאמים אישית נשלחים בצורת אבקה יבשה.עדיף להמיס מחדש את הפריימרים ב-TE כך שהריכוז הסופי יהיה 100μM.TE עדיף על מים דה-יוניים מכיוון שה-pH של המים הוא לרוב חומצי ויגרום להידרוליזה של אוליגונוקלאוזידים.
יציבות הפריימרים תלויה בתנאי האחסון.יש לאחסן אבקה יבשה ופריימרים מומסים ב-20℃.פריימרים המומסים ב-TE בריכוזים הגבוהים מ-10μM יכולים להיות מאוחסנים ביציבות ב-20℃ למשך 6 חודשים, אך ניתן לאחסן אותם רק בטמפרטורת החדר (15℃ עד 30℃) למשך פחות משבוע.ניתן לאחסן פריימרים אבקה יבשים ב-20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפחות ובטמפרטורת החדר (15 מעלות צלזיוס עד 30 מעלות צלזיוס) עד חודשיים.
5. אנזימים וריכוזיהם
נכון לעכשיו, הפולימראז של Taq DNA הוא בעצם האנזים הנדסת גנים המסונתז על ידי חיידקים קוליפורמים.כמות האנזים הדרושה כדי לזרז תגובת PCR טיפוסית היא בערך 2.5U (מתייחס לנפח התגובה הכולל של 100 ul).אם הריכוז גבוה מדי, זה יכול להוביל להגברה לא ספציפית;אם הריכוז נמוך מדי, כמות המוצר הסינטטי תפחת.
6. איכות וריכוז של dNTP
איכות ה-dNTP קשורה קשר הדוק לריכוז וליעילות של הגברה של PCR.אבקת ה-dNTP היא גרגירית, והשונות שלה מאבדת את פעילותה הביולוגית אם היא מאוחסנת בצורה לא נכונה.תמיסת dNTP היא חומצית, ויש להשתמש בה בריכוז גבוה, עם תמיסת חיץ של 1M NaOH או 1M Tris.HCL כדי להתאים את ה-PH שלה ל-7.0 ~ 7.5, כמות קטנה של אריזות משנה, אחסון קפוא ב-20℃.הקפאה-הפשרה מרובה תביא לפגיעה ב-dNTP.בתגובת PCR, dNTP צריך להיות 50 ~ 200umol/L.במיוחד, יש לשים לב לריכוז של ארבעת ה-DNTPS צריך להיות שווה (הכנת שומה שווה).אם הריכוז של כל אחד מהם שונה מהאחרים (גבוה או נמוך יותר), ייגרם אי התאמה.ריכוז נמוך מדי יפחית את התפוקה של מוצרי PCR.dNTP יכול לשלב עם Mg2+ ולהפחית את הריכוז של Mg2+ חופשי.
7. תבנית (גן מטרה) חומצת גרעין
כמות ודרגת הטיהור של חומצת גרעין תבנית היא אחד הקישורים המרכזיים להצלחה או כישלון של PCR.שיטות טיהור ה-DNA המסורתיות משתמשות בדרך כלל ב-SDS ובפרוטאז K כדי לעכל ולהשליך דגימות.התפקידים העיקריים של SDS הם: להמיס שומנים וחלבונים על ממברנת התא, ובכך להרוס את קרום התא על ידי המסת חלבוני ממברנה, ולנתק חלבונים גרעיניים בתא, SDS יכול גם לשלב עם חלבונים ולהשקיע;פרוטאז K יכול לבצע הידרוליזה ולעכל חלבונים, במיוחד היסטונים הקשורים ל-DNA, ולאחר מכן להשתמש בפנול ממס אורגני וכלורופורם כדי לחלץ חלבונים ורכיבי תאים אחרים, ולהשתמש באתנול או באלכוהול איזופרופיל כדי לזרז חומצת גרעין.חומצת הגרעין המופקת יכולה לשמש כתבנית לתגובות PCR.עבור דגימות זיהוי קליניות כלליות, ניתן להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה להמסת תאים, לליסאציה של פתוגנים, לעכל ולהסיר חלבונים מהכרומוזומים לגני מטרה חופשיים, ולהשתמש ישירות להגברת PCR.מיצוי תבנית RNA משתמש בדרך כלל בשיטת guanidine isothiocyanate או protease K כדי למנוע מ-RNase לפרק RNA.
ריכוז 8.Mg2+
ל-Mg2+ יש השפעה משמעותית על הספציפיות והתפוקה של הגברה של PCR.באופן כללי תגובת PCR, כאשר הריכוז של dNTP שונים הוא 200umol/L, הריכוז המתאים של Mg2+ הוא 1.5 ~ 2.0mmol/L.ריכוז Mg2+ גבוה מדי, סגוליות התגובה יורדת, מתרחשת הגברה לא ספציפית, ריכוז נמוך מדי יקטין את פעילות ה-Taq DNA פולימראז, וכתוצאה מכך הפחתת תוצרי התגובה.
יוני מגנזיום משפיעים על מספר היבטים של PCR, כגון פעילות DNA פולימראז, המשפיעה על התשואה;דוגמה נוספת היא חישול פריימר, המשפיע על הספציפיות.dNTP ותבנית נקשרות ליון מגנזיום, ומפחיתות את כמות יון המגנזיום החופשי הנדרשת לפעילות האנזים.ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי משתנה עבור זוגות פריימר ותבניות שונות, אך ריכוז PCR התחלתי טיפוסי עם 200μM dNTP הוא 1.5mM (הערה: ל-PCR כמותי בזמן אמת, השתמש בתמיסת יוני מגנזיום בגודל 3 עד 5mM עם בדיקה ניאון).ריכוזים גבוהים יותר של יוני מגנזיום חופשיים מגבירים את התפוקה, אך גם מגבירים הגברה לא ספציפית ומפחיתים את הנאמנות.כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי, בוצעו טיטרציות של יוני מגנזיום במרווחים של 0.5mM מ-1mM ל-3mM.כדי להפחית את התלות באופטימיזציה של יוני מגנזיום, ניתן להשתמש בפולימראז של Platinum Taq DNA.פלטינום Taq DNA פולימראז מסוגל לשמור על תפקוד על פני מגוון רחב יותר של ריכוזי יוני מגנזיום מאשר Taq DNA פולימראז ולכן דורש פחות אופטימיזציה.
9. תוספים מקדמי Pcr
אופטימיזציה של טמפרטורת חישול, עיצוב פריימר וריכוז יוני מגנזיום מספיקה להגברה ספציפית ביותר של רוב התבניות;עם זאת, תבניות מסוימות, כולל אלו עם תוכן GC גבוה, דורשות אמצעים נוספים.תוספים המשפיעים על טמפרטורת ההיתוך של ה-DNA מספקים דרך נוספת לשפר את הספציפיות והתפוקה של המוצר.נדרש דנטורציה מלאה של התבנית לתוצאות הטובות ביותר.
בנוסף, המבנה המשני מונע קישור פריימר והארכת אנזים.
תוספי PCR, כולל פורמאמיד, DMSO, גליצרין, בטאין ותמיסת PCRx Enhancer, משפרים את ההגברה.המנגנון האפשרי שלהם הוא להפחית את טמפרטורת ההיתוך, ובכך לסייע בחישול של פריימרים ולסייע בהארכת DNA פולימראז דרך אזור המבנה המשני.לפתרון PCRx יש יתרונות נוספים.נדרש אופטימיזציה מינימלית של יוני מגנזיום בשימוש עם Platinum Taq DNA פולימראז ו-Platinum Pfx DNA.לפיכך, טכניקת הפלטינום משולבת עם התוסף להגברת הספציפיות תוך הפחתת התלות של הגישה השלישית, אופטימיזציה של יוני מגנזיום.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לייעל את ריכוז התוספים, במיוחד DMSO, פורמאמיד וגליצרול, המעכבים את פולימראז ה-Taq DNA.
10. התחלה חמה
התחלה חמה PCR היא אחת השיטות החשובות ביותר לשיפור ספציפיות PCR בנוסף לתכנון פריימר טוב.למרות שטמפרטורת ההתארכות האופטימלית של Taq DNA פולימראז היא 72℃, הפולימראז נשאר פעיל בטמפרטורת החדר.לפיכך, מוצרים לא ספציפיים מיוצרים כאשר טמפרטורת ההחזקה נמוכה מטמפרטורת החישול במהלך הכנת תגובת ה-PCR ובתחילת המחזור התרמי.לאחר היווצרותם, המוצרים הלא ספציפיים הללו מוגברים ביעילות.PCR עם התחלה חמה יעיל במיוחד כאשר האתרים המשמשים לעיצוב פריימר מוגבלים על ידי מיקומם של אלמנטים גנטיים, כגון מוטציות מכוונות אתרים, שיבוט ביטוי או בנייה ומניפולציה של אלמנטים גנטיים המשמשים להנדסת DNA.
שיטה נפוצה להגבלת הפעילות של Taq DNA פולימראז היא הכנת תמיסת תגובת PCR על קרח והנחתה במנגנון PCR מחומם מראש.שיטה זו פשוטה וזולה, אך אינה משלימה את פעילות האנזים ולכן אינה מבטלת לחלוטין את ההגברה של מוצרים לא ספציפיים.
תחול תרמי מעכב את סינתזת ה-DNA על ידי עיכוב של רכיב חיוני עד שמנגנון ה-PCR מגיע לטמפרטורת הדנטורציה.רוב שיטות ההתחלה התרמיות הידניות, כולל הוספה מאוחרת של Taq DNA פולימראז, הן מסורבלות, במיוחד עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה.שיטות תחול תרמיות אחרות משתמשות במגן שעווה כדי לסגור רכיב חיוני, כולל יוני מגנזיום או אנזימים, או כדי לבודד פיזית רכיבים תגובתיים, כגון תבניות ומאגרים.במהלך המחזור התרמי, הרכיבים השונים משתחררים ומתערבבים יחדיו כאשר השעווה נמסה.בדומה לשיטת ההתחלה החמה הידנית, שיטת מגן השעווה מסורבלת ונוטה לזיהום ואינה מתאימה ליישומים בתפוקה גבוהה.
פלטינום DNA פולימראז נוח ויעיל ל-PCR אוטומטי של התחלה חמה.פלטינום Taq DNA פולימראז מורכב מפולימראז Taq DNA רקומביננטי בשילוב עם נוגדן חד שבטי נגד Taq DNA פולימראז.הנוגדנים מנוסחים על ידי PCR כדי לעכב את פעילות האנזים במהלך החזקת טמפרטורה ממושכת.Taq DNA פולימראז שוחרר לתגובה במהלך הבידוד של 94℃ של שלב הדנטורציה, משחזר את פעילות הפולימראז המלאה.בניגוד ל-Taq DNA פולימראז שעבר שינוי כימי להפעלה תרמית, אנזים פלטינום אינו דורש בידוד ממושך ב-94℃ (10 עד 15 דקות) כדי להפעיל את הפולימראז.עם PlatinumTaq DNA פולימראז, 90% מפעילות ה-Taq DNA פולימראז שוחזרה לאחר 2 דקות ב-94℃.
11. Nest-PCR
סבבים עוקבים של הגברה באמצעות פריימרים מקוננים יכולים לשפר את הספציפיות והרגישות.הסיבוב הראשון הוא הגברה סטנדרטית של 15 עד 20 מחזורים.חלק קטן ממוצר ההגברה הראשוני דולל 100 עד 1000 פעמים והוסיף לסבב השני של ההגברה במשך 15 עד 20 מחזורים.לחלופין, ניתן להתאים את המוצר המוגבר הראשוני על ידי טיהור ג'ל.בסיבוב השני של ההגברה נעשה שימוש בפריימר מקונן, שיכול להיקשר לרצף המטרה בתוך הפריימר הראשון.השימוש ב-PCR מקונן מפחית את האפשרות להגברה של אתרי יעד מרובים מכיוון שיש מעט רצפי מטרה המשלימים לשתי קבוצות הפריימרים.אותו מספר כולל של מחזורים (30 עד 40) עם אותם פריימרים הגבירו את האתרים הלא ספציפיים.PCR מקונן מגביר את הרגישות של רצפי מטרה מוגבלים (למשל, mrnas נדירים) ומשפר את הספציפיות של PCRS קשה (למשל 5' RACE).
12. PCR יורד
PCR יורד משפר את הספציפיות על ידי שימוש בתנאי חישול הדוקים עבור המחזורים הראשונים של PCR.המחזור מתחיל בטמפרטורת חישול הגבוהה בכ-5℃ מה-Tm המשוער, ואז כל מחזור מופחת ב-1 ℃ עד 2℃ עד שטמפרטורת החישול תהיה מתחת ל- Tm 5℃.רק תבנית היעד עם ההומולוגיה הגבוהה ביותר תוגבר.מוצרים אלה ממשיכים להתרחב במחזורים הבאים, ודוחקים את המוצרים הלא ספציפיים המוגברים.PCR יורד שימושי עבור שיטות שבהן מידת ההומולוגיה בין הפריימר לתבנית המטרה אינה ידועה, כגון טביעת אצבע של AFLP DNA.
ערכות PCR קשורות
גיבור 2× PCRTMלמערכת Mix יש סבילות גבוהה יותר למעכבי PCR מאשר למערכת PCR Mix הרגילה, והיא יכולה להתמודד בקלות עם הגברה של PCR של תבניות מורכבות שונות.מערכת התגובה הייחודית וה-Taq Hero ביעילות גבוהה גורמים לתגובת PCR להיות בעלת יעילות הגברה, סגוליות ורגישות גבוהה יותר.
יעילות הגברה גבוהה יותר
יש לו פעילות 5'→3' DNA פולימראז ופעילות 5'→3' exonuclease, ללא פעילות 3'→5' exonuclease.
זמן אמת PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
ספציפי - חיץ אופטימלי ואנזים Taq עם התחלה חמה יכולים למנוע הגברה לא ספציפית ויצירת דימר פריימר
רגישות גבוהה - יכול לזהות עותקים נמוכים של תבנית
הערכה משתמשת במגיב ייחודי לשעתוק הפוך של Foregene וב-Foregene HotStar Taq DNA Polymerase בשילוב עם מערכת תגובה ייחודית כדי לשפר ביעילות את יעילות ההגברה והספציפיות של התגובה.
זמן פרסום: מאי-09-2023
