אני מאמין שכולם תמיד ייתקלו בבעיות כאלה או כאלה בעת ביצוע תגובות PCR, אבל את רובן ניתן לסווג לשתי בעיות עיקריות:

הגברה מועטה מדי של תבנית הגן (הגברה);
יותר מדי הגברת גנים ללא מטרה.
שימוש בתוספים הוא אחת האסטרטגיות הנפוצות לפתרון בעיות אלו.בדרך כלל לתפקיד התוספים יש שני היבטים:
מבנה משנישל גנים (מבנה משני);
הפחת תחול לא ספציפי.
היום, העורך יציג בפניכם בקצרה את התוספים הנפוצים בתגובות PCR ואת תפקידיהם.
תוספים המפחיתים מבנה משני
סולפטוקסיד(DMSO)
דגימות גניםעם תכולת GC גבוהה.עם זאת, DMSO גם מפחית מאוד את פעילות ה-Taq פולימראז.לכן, כל אחד צריך לאזן בין נגישות התבנית לבין פעילות הפולימראז.העורך מציע שתוכל לנסות ריכוזים שונים של DSMO, כגון מ-2% עד 10%, כדי למצוא את הריכוז המתאים לניסוי שלך.
דטרגנטים לא יוניים
חומרי ניקוי לא-יוניים, כגון 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 או NP-40, מפחיתים בדרך כלל את המבנה המשני של ה-DNA.למרות שזה יכול להגביר את ההגברה של גן התבנית, זה גם יגרום לצרות של הגברה לא ספציפית.אז, תוספים אלה עובדים היטב עבור תגובות PCR בעלות תשואה נמוכה ללא פסולת, אך לא כל כך טוב עבור תגובות PRC טמאות יחסית.יתרון נוסף של דטרגנטים לא יוניים הוא הפחתת זיהום SDS.בדרך כלל במהלך תהליך מיצוי ה-DNA יובא SDS לשלב ה-PCR, אשר מעכב מאוד את פעילות הפולימראז.לכן, הוספת 0.5% Tween-20 או Tween-40 לתגובה יכולה לנטרל את ההשפעות השליליות של SDS.
בטאין_
Betaine יכול לשפר את הגברה של DNA על ידי הפחתת היווצרות מבנה משני והוא בדרך כלל תוספת "מסתורית" לערכות PCR מסחריות.אם אתה רוצה להשתמש בטאין, אתה צריך לשים בטאין או בטאין מונו-הידראט (Betaine או Betaine mono-hydrate), אך לא בטאין הידרוכלוריד (Betaine HCl), להתאים לריכוז סופי של 1-1.7M.Betaine יכול גם לעזור לשפר את הספציפיות מכיוון שהוא מבטל את התלות בהרכב זוג הבסיסים של המסת DNA/דנטורציה של DNA.
תוספים להפחתת תחול לא ספציפי
פורמאמיד
פורמאמיד הוא תוסף PCR אורגני נפוץ.זה יכול לשלב עם חריץ ראשי וחריץ מינור ב-DNA, ובכך להפחית את היציבות של הסליל הכפול של ה-DNA הראשי ולהוריד את טמפרטורת ההיתוך של ה-DNA.ריכוז הפורמאמיד בשימוש בניסויי PCR הוא בדרך כלל 1%-5%.
טטרמתילאמוניום כלוריד( TMAC)
Tetramethylammonium chloride יכול להגביר את הספציפיות של הכלאה (סגוליות הכלאה) ולהגביר את טמפרטורת ההיתוך של ה-DNA.לפיכך, TMAC יכול להסיר תחול לא ספציפי ולהפחית חיבור שגוי של DNA ו-RNA.אם אתה משתמשפריימרים מנווניםבתגובת PCR, זכור להוסיף TMAC, המשמש בדרך כלל בריכוז של 15-100mM.
תוספים נפוצים אחרים
בנוסף לשתי קטגוריות התוספים שהוזכרו לעיל, ישנם תוספים נפוצים רבים בתגובות PCR, למרות שיש להם תפקידים שונים, הם גם חשובים מאוד.
יון מגנזיום
יון מגנזיום הוא קופקטור (קופקטור) הכרחי של פולימראז, כלומר ללא יון מגנזיום, פולימראז אינו פעיל.עם זאת, יותר מדי יוני מגנזיום יכול גם להשפיע על יעילות הפולימראז.ריכוז יוני המגנזיום בכל תגובת PCR ישתנה.חומרי קליטה (כגון EDTA או ציטראט), ריכוז ה-dNTPs והחלבונים כולם משפיעים על ריכוז יוני המגנזיום.לכן, אם יש לך בעיות בניסוי ה-PCR שלך, אתה יכול לנסות לשנות ריכוזי יוני מגנזיום שונים, למשל, מ-1.0 ל-4.0 מ"מ, עם מרווח של 0.5-1 מ"מ ביניהם.
ראוי לציין כי מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים יכולים להוביל לריבוד ריכוז של תמיסת המגנזיום כלוריד.לכן יש להמיס אותו לחלוטין לפני כל שימוש, ולערבב היטב לפני השימוש בו.
אלבומין בסרום בקר(אלבומין בקר, BSA)
בניסויים בכימיה מולקולרית, אלבומין בסרום בקר הוא תוסף נפוץ מאוד, במיוחד בניסויי עיכול אנזימים מגבילים ובניסויי PCR.בתגובות PCR, BSA מועיל בהפחתת מזהמים כגון תרכובות פנוליות.ונאמר גם שהוא יכול להפחית את ההידבקות של מגיבים לדופן המבחנה.בתגובת PCR, בדרך כלל ריכוז ה-BSA המוסף יכול להגיע ל-0.8 מ"ג/מ"ל.
 
מוצרים קשורים:
PCR Hero(עם צבע)
PCR Hero