• פייסבוק
  • לינקדאין
  • יוטיוב

אימות הביצועים של פריימרים ובדיקות בשלב מוקדם של ריאגנטים PCR וקביעת תנאי התגובה המתאימים ביותר הם התנאים המוקדמים כדי להבטיח התקדמות חלקה של ניסויים פורמליים.

אז איך אנחנו צריכים לאשר את הפריימר פרוב בשלב מוקדם?

האינדיקטורים העיקריים הם קו בסיס, עקומת הגברה, ערך ct, יעילות הגברה, זיהוי מדגם בריכוז נמוך, קורות חיים וכו'.

קו בסיס

קו הבסיס הוא הקו האופקי בעקומת ההגברה של PCR.במחזורים הראשונים של תגובת הגברה של PCR, אות הקרינה אינו משתנה הרבה ויוצר קו ישר.קו ישר זה הוא קו הבסיס.

בעת בדיקת בדיקות פריימר של PCR, שימו לב אם קו הבסיס ברמה.הטוהר של ריכוז הפריימר פרוב ישפיע על קו הבסיס, כגון גורם לקו הבסיס לעלות או לרדת.קו הבסיס הוא גם אינדיקטור אינטואיטיבי מאוד.
אָנָלִיזָה

עקומת הגברה

אינדיקטור אינטואיטיבי נוסף הוא צורת עקומת ההגברה.עדיף שתהיה עקומה בצורת S כדי להימנע מהגברה משנית או עקומות הגברה חריגות אחרות.
ריק

ערך Ct

מספר המחזורים המתאימים לנקודת הפיתול מקו הבסיס לצמיחה המעריכית הוא ערך Ct.

עבור אותה דגימה, בדיקות פריימר שונות מביאות לעקומות הגברה שונות, וערך ה-Ct המתאים יושפע מיעילות ההגברה ומדרגת ההפרעה.בתיאוריה, ככל שערך ה-Ct של ה-primer probe שנבחר קטן יותר, כך ייטב.

ניתוח-3

יעילות הגברה

אחת השיטות האמינות והיציבות ביותר להערכת יעילות הגברה של PCR היא העקומה הסטנדרטית, המוכרת גם על ידי חוקרים.השיטה כוללת יצירת סדרה של דוגמאות כדי לשלוט במספר היחסי של תבניות יעד.דגימות אלו נעשות בדרך כלל על ידי דילול סדרתי של תמיסות מניות מרוכזות, הנפוץ ביותר בשימוש הוא דילול פי 10.שימוש בסדרה של דגימות מדוללות, שימוש בתוכנית qPCR סטנדרטית להגברה לקבלת ערך Cq, ולבסוף צייר עקומה סטנדרטית לפי הריכוז של כל דגימה וערך Cq המתאים כדי לקבל את המשוואה הליניארית Cq= -klgX0+b, ואת יעילות ההגברה E=10(-1 /k)-1.בעת שימוש ב-qPCR לניתוח כמותי, יעילות ההגברה נדרשת להיות בטווח של 90%-110% (3.6>k>3.1).

ניתוח-4

זיהוי דגימות בריכוז נמוך

כאשר ריכוז הדגימה נמוך, שיעורי הזיהוי של בדיקות פריימר שונות שונות.אנו בוחרים 20 דגימות בריכוז נמוך לשכפול, ומערכת ה-primer-probe עם שיעור הזיהוי הגבוה ביותר היא הטובה ביותר.

ניתוח-5

מקדם וריאציה (CV)

ניתן לזהות 10 דגימות כפולות עם בדיקות פריימר שונות בהתאם לתקן הקו של המגיב לזיהוי הגברה של חומצת גרעין.

ניתוח-6

ריאגנטים כמותיים:
דיוק
הדיוק בתוך אצווה אחת צריך לעמוד: מקדם השונות (CV,%) של הערך הלוגריתמי של ריכוז הבדיקה הוא ≤5%.כאשר ריכוז הדגימה נמוך, מקדם השונות (CV,%) של הלוגריתם של ריכוז הזיהוי הוא ≤10%


ריאגנטים איכותיים:
דיוק
הדיוק בתוך אצווה אחת צריך לעמוד ב:

(1) מקדם וריאציה של ערך Ct (CV,%) ≤5%

אותה דגימה נבדקת במקביל במשך 10 פעמים, ותוצאות הבדיקה צריכות להיות עקביות


זמן פרסום: 18 בספטמבר 2021