מחברים: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

יחידה: בית החולים Jiaozhou, בית החולים דונגפאנג ​​המסונף לאוניברסיטת טונגג'י

כיום, סוג הדגימה העיקרי לזיהוי חומצות גרעין של פתוגן נשימתי הוא משטח גרון.ישנם סוגים רבים של פתרונות שימור דגימות נפוצים, שכולם צריכים להיות בקירור או הקפאה לצורך הובלה ואחסון;קשה לשלוט על כל התהליך של טמפרטורה נמוכה במהלך תהליך האיסוף וההובלה, וקשה להבטיח את בקרת האיכות לפני בדיקת מדגם^[1-2].

RNase (RNase) הוא אנדונוקלאז המעביר הידרוליזה של RNA, בעיקר מנתק קשרי פוספודיסטר בין נוקלאוטידים.מולקולת ה-RNase יציבה מאוד, קיימים קשרים דיסולפידים במבנה, ופעילותה אינה מצריכה נוכחות של קטיונים דו ערכיים, כך שה-RNase אינו עובר דנטורציה בקלות, וקל לבצע אותו מחדש גם לאחר טמפרטורה גבוהה או שימוש בדנטורנטים.RNases מחולקים אנדוגניים ואקסוגניים.ניתן לשחרר את ה-RNases האנדוגני באותו זמן כאשר תאים נקרעים.לכן, ביטול התפקיד של RNases אנדוגניים הוא שלב קריטי מאוד בתהליך מיצוי ה-RNA.RNases אקסוגניים מופצים באופן נרחב.RNases קיימים באוויר, בעור האדם, בשיער וברוק, שהם סיבות חשובות לפירוק קל של RNA^[3].

שאילתת נתונים

CANS-CL02-A009 "יישום הנחיות הסמכה לאיכות מעבדה רפואית בתחום האבחון המולקולרי" בדרישות הטכניות מציע כי יש לנסח תקני איכות מים מתאימים בהתאם לבקשה;מיכלים חד פעמיים אטומים:

RNase/סיווג

(1) RNase A

ריבונוקלאז A (RNase A), שמקורו בלבלב בקר, הוא אנדוריבונוקלאז שיכול לתקוף באופן ספציפי את קצה 3' של שיירי פירמידין על RNA, לחתוך ציטוזין או אורציל הנוצרים על ידי נוקלאוטידים סמוכים.קשר פוספודיסטר, התוצר הסופי של התגובה הוא נוקלאוטיד פירמידין 3′ ואוליגונוקלאוטיד עם נוקלאוטיד פירמידין 3′ בסופו.

(2) RNase T1

Ribonuclease T1 (RNase T1) נגזר מ- Aspergillus orjzae, הוא פועל ספציפית על הפוספט ה-3'-טרמינלי של גואנין, ואתר המחשוף הוא בין הפוספט 3' של גואנין והידרוקסיל 5' של נוקלאוטידים סמוכים.התוצר הסופי של התגובה הוא חומצה 3'גואנילית ושברי אוליגונוקלאוטידים עם חומצה 3'גואנילית בסוף.

(3) RNase H

Ribonuclease H (RNase H) התגלה לראשונה מרקמת התימוס של העגל, והגן המקודד שלו שובט לתוך Escherichia coli.זה יכול לפרק DNA באופן ספציפי: גדילי RNA בדופלקסים היברידיים של RNA, וכתוצאה מכך אוליגונוקלאוטידים ומונונוקלאוטידים עם קצוות 3'-OH ו-5'-מונופוספטים, הוא לא יכול לפרק DNA או RNA חד-גדילי או דו-גדילי.

RNase

תפקוד ושימוש

ריבונוקלאז יכול לזרז את הפירוק של חומצה ריבונוקלאית (RNA) וניתן לסנתז אותו באופן מלאכותי.משחה רפואית משמשת באופן מקומי לטיפול בטראומה וכאבי מפרקים.על פי דיווחים, ריבונוקלאז יכול לשנות את חילוף החומרים של התא המאכסן, לעכב את סינתזת הנגיפים, לעכב את התפשטות נגיף השפעת במבחנה ולעכב היווצרות של וירוס חיסון ונגיף הרפס בעוברי עוף.שימוש קליני של ribonuclease הזרקה יומית תוך שרירית של 180 מ"ג, מועיל לטיפול בדלקת מוח מגיפה, ribonuclease יכול לזרז את הפירוק של חומצה ribonucleic (RNA), וכעת ניתן לסנתז אותו באופן מלאכותי.משחה רפואית משמשת באופן מקומי לטיפול בטראומה וכאבי מפרקים.על פי דיווחים, ריבונוקלאז יכול לשנות את חילוף החומרים של התא המאכסן, לעכב את סינתזת הנגיפים, לעכב את התפשטות נגיף השפעת במבחנה ולעכב היווצרות של וירוס חיסון ונגיף הרפס בעוברי עוף.שימוש קליני בזריקה תוך שרירית יומית של ribonuclease של 180 מ"ג מועיל לטיפול בדלקת מוח מגיפה.

RNase

הגדרת מעכב

הגדרה של יחידת מעכבי RNase: כמות האנזים הנדרשת כדי לעכב 50% מהפעילות של 5ng RNase A היא יחידה אחת.

כיצד פועלים מעכבי RNase

גואנידין איזותיוציאנט:

Guanidine isothiocyanate הוא תרכובת אורגנית עם הנוסחה המולקולרית C2H6N4S.משמש בעיקר ברפואה ביולוגית, ריאגנטים כימיים וכו'. Guanidine isothiocyanate הוא חומר ליטוש חלבון, והוא משמש לעתים קרובות כמרכיב העיקרי של תמיסת תמוגה בריאגנטים לאבחון מולקולרי.הוא יכול לרזות רקמות, להרוס את מבנה התא ולנתק חומצת גרעין מנוקלאופרוטאין, ויש לו דנטורציה חזקה ל-RNase.זהו מעכב ה-RNase היעיל ביותר כיום.

TRIzol הוא מגיב חדש למיצוי RNA הכולל שיכול לחלץ ישירות RNA מלא מתאי או רקמות.הוא מכיל חומרים כמו פנול וגואנידין איזוטיוציאנאט, שיכולים לשבש במהירות תאים ולעכב נוקלאזות המשתחררות על ידי תאים.

(עם זאת, ה-guanidine isothiocyanate מסוכן לבריאותם של חוקרי מעבדה.)

RNAsin:

גליקופרוטאין חומצי המופק מכבד חולדה או בלסטודרם אנושי.Rnasin הוא מעכב לא תחרותי של RNase, שיכול להיקשר ל-RNases שונים כדי להשבית אותם.

(פרטים נוספים: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hטמפרטורה גבוהה:

טמפרטורה גבוהה היא גם אמצעי נפוץ לדנטורציה של חלבון.

דיאתיל פירוקרבונט (DEPC):

DEPC הוא מעכב RNase חזק אך לא שלם, שיכול לעכב את פעילות RNase על ידי שילוב עם טבעת חומצת האמינו imidazole של הקבוצה הפעילה RNase כדי לדחות חלבונים.

קומפלקס Vanadyl ribonucleoside:

קומפלקס שנוצר על ידי יוני תחמוצת ונדיום ונוקלאוזידים, הנקשר ל-RNase בצורה של חומרי מעבר, שיכולים לעכב כמעט לחלוטין את פעילותו של RNase

אַחֵר:

ל-SDS, אוריאה, אדמה דיאטומית וכו' יש גם השפעה מעכבת מסוימת על RNase.

ביקורות מומחים

לי יוג'י טכנאי ראשי

מנהל מחלקת המעבדה, בית החולים Jiaozhou, בית החולים דונגפאנג ​​המסונף לאוניברסיטת טונגג'י

על מנת למנוע את הפירוק הביולוגי של RNase אקסוגני, יש ללבוש מסכות, כפפות וכובעים ולהחליף אותם לעתים קרובות במהלך תהליך מיצוי ה-RNA.יש לאפות את כל כלי הזכוכית בתנור ייבוש ב-200 מעלות צלזיוס במשך יותר משעתיים.חומרים המשמשים לאפייה, כגון פלסטיק, צריכים להיות מטופלים במי DEPC, ולאחר מכן לשטוף אותם במים מזוקקים.הריאגנטים או המכשירים המשמשים למיצוי, שימור וזיהוי של RNA צריכים להיות מוקדשים ל-RNA, ויש להקים אזור פעולה עצמאי של RNA.

הפניות:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.חיידקים ווירוסים בלוע האף מיד לפני הופעת זיהומים חריפים בדרכי הנשימה התחתונה בילדים ילידי אוסטרליה[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] סניף לבקרת זיהומים בבתי חולים של האגודה הסינית לרפואה מונעת.הנחיות לאיסוף ובדיקה של דגימות מיקרוביאליות קליניות [J].Journal Chinese of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] "בדיקה קלינית עשרת אלפים מדוע נפח בדיקות ביולוגיה מולקולרית"