בשלב מוקדם של ההתפרצות, בשל ההתפתחות המהירה, אבחון מהיר של חולים חשודים הוא המפתח למניעת COVID-19.לחלק מגיבים מאושרים לזיהוי חומצות גרעין יש זמן פיתוח קצר, ויש בעיות כמו אישור ביצועים נמהר, אופטימיזציה לא מספקת של ריאגנטים והבדלים גדולים בין אצוות;הבעיות של מעבדות קליניות שונות בהיבטים שונים של תהליך גילוי חומצות גרעין עשויות להשפיע גם על הדיוק של תוצאות גילוי חומצות גרעין.מאמר זה יתמקד בקישורים ובנקודות העיקריות בזיהוי חומצות הגרעין SARS-CoV-2 הנוכחיות, וינתח את הבעיות של בדיקה מחדש שלילית וחיובית כוזבת של זיהוי חומצות גרעין במעבדה וחוסר עקביות קלינית.

עקרונות של זיהוי חומצות גרעין SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 הוא נגיף RNA עם רצף גנום של כ-29 קילו-בייט, עם 10 גנים, שיכולים לקודד ביעילות 10 חלבונים.נגיפים מורכבים מ-RNA וחלבון, והשכבה החיצונית ביותר היא ציפוי חיצוני המורכב משומנים וגליקופרוטאינים.בפנים, הקפסיד החלבון עוטף בו את ה-RNA, ובכך מגן על ה-RNA המתכלה בקלות (P1).

מבנה P1 של SARS-COV-2

וירוסים פולשים לתאים דרך קולטנים ספציפיים משטח התא כדי לגרום לזיהום, ומשתמשים בתאי מארח כדי לשכפל.

העיקרון של זיהוי חומצות גרעין נגיפיות הוא לחשוף את ה-RNA הנגיפי דרך תאי תא, ולאחר מכן להשתמש בתגובת שרשרת של תעתוק הפוכה פלואורסצנטי בזמן אמת (RT-PCR) לזיהוי.

המפתח לעקרון הגילוי הוא להשתמש בפריימרים ובבדיקות כדי להשיג "התאמה ממוקדת" של רצפי חומצות גרעין, כלומר למצוא את רצף חומצות הגרעין של SARS-CoV-2 השונה מווירוסים אחרים בכ-30,000 בסיסים (הדמיון של חומצת גרעין לווירוסים אחרים) אזור "נמוך"), עיצוב פריימרים ובדיקות.

הפריימרים והפרובים מתאימים מאוד לאזור הספציפי של חומצת הגרעין SARS-CoV-2, כלומר, הספציפיות חזקה מאוד.ברגע שתוצאת ההגברה הניאון-RT-PCR בזמן אמת של הדגימה שתיבדק היא חיובית, היא מוכיחה ש-SARS-CoV-2 קיים בדגימה.ראה P2.

P2 שלבים של קביעת חומצת גרעין SARS-CoV-2 (RT-PCR ניאון בזמן אמת)

תנאים ודרישות של מעבדה לאיתור חומצות גרעין SARS-CoV-2

מעבדות לבדיקת חומצות גרעין הן האידיאליות ביותר עבור סביבות לחץ שלילי, והן צריכות לשים לב לניטור לחץ, לשמור על זרימת האוויר ולחסל אירוסולים.צוות בדיקת חומצות גרעין חייב להיות בעל כישורים מתאימים, לקבל הכשרה רלוונטית לתגובת שרשרת פולימראז ולעבור את ההערכה.המעבדה צריכה להיות מנוהלת בקפדנות, לחלק אותה במקום, וחל איסור מוחלט על כניסת אנשים לא רלוונטיים.יש לאוורר את האזור הנקי ולחטא אותו במקום.פריטים רלוונטיים ממוקמים באזורים, נקיים ומלוכלכים מופרדים, מוחלפים בזמן, ומטוהמים במקום.חיטוי שגרתי: חומר חיטוי המכיל כלור הוא הפתרון העיקרי לשטחים גדולים יותר, וניתן להשתמש ב-75% אלכוהול לאזורים קטנים.דרך טובה להתמודד עם אירוסולים היא פתיחת חלונות לאוורור, וניתן לבצע חיטוי אוויר גם באמצעות קרניים אולטרה סגולות, סינון וחיטוי אוויר.

קישורים ופרמטרים מרכזיים של קביעת חומצת גרעין SARS-CoV-2 (RT-PCR ניאון בזמן אמת)

למרות שבדרך כלל מעבדות מקדישות תשומת לב רבה ל"גילוי חומצות גרעין", למעשה, "חילוץ" חומצת גרעין היא גם אחד השלבים המרכזיים לגילוי מוצלח, הקשור קשר הדוק לאיסוף ואחסון של דגימות וירוסים.

כיום, דגימות הנשימה הנפוצות ביותר, כגון משטחי אף-לוע, משתמשים בשיטה השנייה, שהיא תמיסת אינאקטיבציה (שימור) שהוכנה על בסיס מיצוי חומצת גרעין ותמיסת תמוגה.מצד אחד, תמיסת שימור וירוס זו עלולה לדנטורציה של חלבון הנגיף, לאבד את פעילותו ולא להיות מדבקת יותר ולשפר את בטיחות שלב ההובלה והגילוי;מצד שני, הוא יכול לפצח ישירות את הנגיף כדי לשחרר את חומצת הגרעין, לחסל את האנזים המתפרק חומצת גרעין ולמנוע את הנגיף.ה-RNA מתכלה.

תמיסת דגימת וירוס שהוכנה על בסיס תמיסת מיצוי חומצת גרעין.המרכיבים העיקריים הם מלחים מאוזנים, חומר קלתי של חומצה אתילן-דיאמין-טטרה-אצטית, מלח גואנידין (גואנידין איזותיוציאנט, גואנידין הידרוכלוריד וכו'), חומר פעיל שטח אניוני (דודקן) נתרן סולפט), פעיל שטח קטיוני (טטראדציל טרימתיל אמוניום אוקסלט), רכיבי דיט-הידרוקסינולין ו-8 נוספים, דיט-הידרוקסינולין, עוד מספר רכיבים של חלבון, דיטהירוקנול, K.כיום, ישנם סוגים רבים של ערכות מיצוי חומצות גרעין, ומשתמשים בריאגנטים שונים לחילוץ וטיהור חומצות גרעין.גם אם נעשה שימוש באותו מגיב למיצוי וטיהור של חומצת גרעין, הליכי המיצוי של כל ערכה שונים.

נכון לעכשיו, מוצרי ערכת זיהוי חומצות הגרעין שאושרו על ידי המינהל הלאומי למוצרים רפואיים נבחרים על סמך הגנים ORF1ab, E ו-N בגנום SARS-CoV-2.עקרונות הזיהוי של מוצרים שונים זהים בעצם, אך עיצובי הפריימרים והבדיקה שלהם שונים.ישנם מקטעי יעד בודדים (ORF1ab), מקטעי יעד כפולים (ORF1ab, N או E), ומקטעים בעלי שלושה יעדים (ORF1ab, N ו-E).ההבדל בין זיהוי ופרשנות, מיצוי חומצת גרעין ומערכת תגובה פלורסנטית RT-PCR בזמן אמת צריך להתייחס להוראות הערכה הרלוונטיות, ומומלץ למשתמשים לעקוב בקפדנות אחר שיטת הפירוש המצוינת בהוראות הערכה לפרשנות.האזורים הנפוצים, הפריימרים ורצפי הבדיקה המוגברים על ידי RT-PCR ניאון בזמן אמת מוצגים ב-P3.

P3 המיקום של יעד האמפליקון SARS-CoV-2 על הגנום ורצף הפריימרים והבדיקות

פרשנות של התוצאות של קביעת חומצות גרעין SARS-CoV-2 (Rאל-Time ניאון RT-PCR)

"תוכנית למניעה ובקרה של דלקת ריאות עבור זיהום ב-SARS-CoV-2 (מהדורה שנייה)" הבהירה לראשונה את הקריטריונים לשיפוט התוצאות של הגברה של גן בודד:

1. אין Ct או Ct≥40 שלילי;

2. Ct<37 חיובי;

3. ערך Ct של 37-40 הוא שטח הסולם האפור.מומלץ לחזור על הניסוי.אם לתוצאה של ביצוע מחדש של Ct<40 ועקומת ההגברה יש שיאים ברורים, המדגם נשפט כחיובי, אחרת הוא שלילי".

המהדורה השלישית של המדריך והמהדורה הרביעית של המדריך המשיכו את הקריטריונים לעיל.עם זאת, בשל המטרות השונות המשמשות בערכות מסחריות, המהדורה השלישית הנ"ל של המדריך לא קבעה את הקריטריונים לקביעת שילוב המטרות, תוך הדגשה שההוראות שסופקו על ידי היצרן יגברו.החל מהמהדורה החמישית של ההנחיות, הובהרו שני יעדים, בעיקר קריטריוני השיפוט של יעד בודד שקשה לשפוט.כלומר, אם המעבדה רוצה לאשר שמקרה חיובי לזיהוי חומצת גרעין SARS-CoV-2, יש לעמוד בתנאים הבאים ב-1 מתוך 2 תנאים:

(1) שני מטרות של SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) באותה דגימה נבדקו חיוביות על ידי RT-PCR ניאון בזמן אמת.אם יעד בודד חיובי, נדרשות דגימה מחדש ובדיקה חוזרת.אם תוצאות הבדיקה הן אם היעד היחיד עדיין חיובי, הוא נחשב חיובי.

(2) שתי דגימות של RT-PCR פלואורסצנטי בזמן אמת הראו מטרה אחת חיובית באותו הזמן או שתי דגימות מאותו סוג הראו תוצאת בדיקה חיובית של מטרה אחת, שניתן לשפוט אותה כחיובית.עם זאת, ההנחיות גם מדגישות שהתוצאות השליליות של בדיקת חומצות גרעין אינן יכולות לשלול זיהום ב-SARS-CoV-2.יש לשלול גורמים שעלולים לגרום לשלילי שווא, כולל איכות דגימה ירודה (דגימות נשימתיות מאורופרינקס ומחלקים אחרים), איסוף דגימות מוקדם מדי או מאוחר מדי, דגימות לא אוחסנו, הועברו ועובדו בצורה נכונה, ולטכנולוגיה עצמה היו בעיות (וריאציות וירוסים, עיכוב PCR) וכו'.

סיבות שליליות כוזבות בזיהוי SARS-CoV-2

המושג "שלילי שגוי" בבדיקת חומצות גרעין המודאג כיום, מתייחס לעתים קרובות ל"שליליות כוזבות" שבהן תוצאות בדיקת חומצת הגרעין אינן עולות בקנה אחד עם ביטויים קליניים, כלומר, סימפטומים קליניים ותוצאות הדמיה חשודות מאוד ב-COVID-19, אך בדיקות חומצת גרעין הן תמיד "שליליות" פעמים רבות.מרכז המעבדה הקלינית של נציבות הבריאות הלאומית הסביר את בדיקת SARS-CoV-2 "שלילית כוזבת".

(1) יש כמות מסוימת של וירוס בתאי האדם הנגוע.הנתונים הקיימים מראים כי לאחר שהגוף נדבק בנגיף, הנגיף חודר לגרון דרך האף והפה, לאחר מכן לקנה הנשימה והסמפונות, ואז מגיע אל המכתשים.האדם הנגוע יחווה את תקופת הדגירה, תסמינים קלים, ולאחר מכן תהליך של תסמינים חמורים ושלבים שונים של המחלה.וכמות הנגיף הקיימת בחלקים שונים בגוף שונה.

מבחינת העומס הנגיפי של סוגי תאים, תאי אפיתל מכתשית (דרכי נשימה תחתונות)> תאי אפיתל בדרכי הנשימה (דרכי נשימה עליונות)> פיברובלסטים, תאי אנדותל ומקרופאגים וכו';מטיפוס הדגימה, נוזל שטיפה מכתשית (המצוין ביותר)>כיח שיעול עמוק>משטח לוע האף>משטח לוע אורופלי>דם.בנוסף, ניתן לזהות את הנגיף גם בצואה.עם זאת, בהתחשב בנוחות הניתוח וקבלת המטופלים, סדר הדגימות הקליניות הנפוץ הוא ספוגית פה-לוע>משטח לוע האף>נוזל שטיפה של הסימפונות (ניתוח מורכב) וליחה עמוקה (בדרך כלל שיעול יבש, קשה להשגה).

לכן, כמות הנגיף בתאי הלוע או האף של חלק מהחולים קטנה או נמוכה במיוחד.אם נלקחות רק דגימות של הלוע או האף לבדיקה, חומצת הגרעין הוויראלית לא תתגלה.

(2) לא נאספו תאים המכילים וירוס במהלך איסוף הדגימות, או חומצת גרעין ויראלית לא נשמרה ביעילות.

[① אתר איסוף לא תקין, למשל, בעת איסוף ספוגיות פה-לוע, עומק האיסוף אינו מספיק, ספוגיות האף-לוע שנאספו אינן נאספות עמוק בחלל האף וכו'. רוב התאים שנאספו עשויים להיות תאים נטולי וירוסים;

②מקלוני דגימה משמשים באופן שגוי.לדוגמה, סיבים סינתטיים כמו סיבי PE, סיבי פוליאסטר וסיבי פוליפרופילן מומלצים לחומר של ראש הספוגית.סיבים טבעיים כגון כותנה משמשים בפעולה בפועל (ספיחה חזקה של חלבון ולא קל לשטיפה) וסיבי ניילון (ספיגת מים לקויה, המובילה לנפח דגימה לא מספיק);

③שימוש לא נכון בצינורות אחסון וירוסים, כגון שימוש לרעה בצינורות אחסון מפוליפרופילן או פוליאתילן מפלסטיק שקל לספוג חומצות גרעין (DNA/RNA), וכתוצאה מכך ירידה בריכוז חומצת הגרעין בתמיסת האחסון.בפועל, מומלץ להשתמש בפלסטיק פוליאתילן-פרופילן פולימר ובכמה מכלי פלסטיק פוליפרופילן מטופלים במיוחד לאחסון חומצות גרעין ויראליות.]

[① אתר איסוף לא תקין, למשל, בעת איסוף ספוגיות פה-לוע, עומק האיסוף אינו מספיק, ספוגיות האף-לוע שנאספו אינן נאספות עמוק בחלל האף וכו'. רוב התאים שנאספו עשויים להיות תאים נטולי וירוסים;

②מקלוני דגימה משמשים באופן שגוי.לדוגמה, סיבים סינתטיים כמו סיבי PE, סיבי פוליאסטר וסיבי פוליפרופילן מומלצים לחומר של ראש הספוגית.סיבים טבעיים כגון כותנה משמשים בפעולה בפועל (ספיחה חזקה של חלבון ולא קל לשטיפה) וסיבי ניילון (ספיגת מים לקויה, המובילה לנפח דגימה לא מספיק);

③שימוש לא נכון בצינורות אחסון וירוסים, כגון שימוש לרעה בצינורות אחסון מפוליפרופילן או פוליאתילן מפלסטיק שקל לספוג חומצות גרעין (DNA/RNA), וכתוצאה מכך ירידה בריכוז חומצת הגרעין בתמיסת האחסון.בפועל, מומלץ להשתמש בפלסטיק פוליאתילן-פרופילן פולימר ובכמה מכלי פלסטיק פוליפרופילן מטופלים במיוחד לאחסון חומצות גרעין ויראליות.]

(4) פעולת המעבדה הקלינית אינה סטנדרטית.תנאי הובלה ואחסנה של דוגמאות, תפעול סטנדרטי של מעבדות קליניות, פרשנות תוצאות ובקרת איכות הם גורמי המפתח להבטחת הדיוק והאמינות של תוצאות הבדיקה.על פי תוצאות הערכת האיכות החיצונית שבוצעה על ידי מרכז המעבדה הקלינית של נציבות הבריאות הלאומית בתאריכים 16-24 במרץ 2020, מתוך 844 מעבדות שקיבלו תוצאות תקפות, 701 (83.1%) הוסמכו ו-143 (16.9%) לא.מוסמך, תנאי בדיקת המעבדה הכוללים טובים, אך במעבדות שונות עדיין יש הבדלים ביכולת תפעול כוח אדם, יכולת פירוש מדגם חיובי של יעד יחיד ובקרת איכות.

כיצד להפחית את השלילי הכוזב של זיהוי חומצות גרעין SARS-CoV-2?

יש לבצע אופטימיזציה של הפחתת שליליות כוזבות בזיהוי חומצות גרעין מארבעת ההיבטים של ייצור שליליים כוזבים.

(1) יש כמות מסוימת של וירוס בתאים של האדם הנגוע.ריכוז הנגיף בחלקים שונים בגוף של אנשים חשודים בנגיף יהיה שונה בזמנים שונים.אם אין לוע, ייתכן שהוא נמצא בנוזל שטיפת הסימפונות או בצואה.אם ניתן לאסוף מספר סוגים של דגימות בו-זמנית או בשלבים שונים של התקדמות המחלה לצורך בדיקה, יעזור למנוע תוצאות שליליות כוזבות.

(2) יש לאסוף תאים המכילים וירוס במהלך איסוף הדגימות.ניתן לפתור בעיה זו במידה רבה על ידי חיזוק ההכשרה של אספני דגימות.

(3) ריאגנטים IVD אמינים.על ידי ביצוע מחקר על הערכת ביצועי הגילוי של ריאגנטים ברמה הלאומית, ודיון בבעיות הקיימות, ניתן לשפר עוד יותר את יעילות הגילוי של ריאגנטים ולשפר את רגישות הניתוח.

(4) תפעול סטנדרטי של מעבדות קליניות.באמצעות חיזוק הכשרת אנשי המעבדה, שיפור מתמיד של מערכת ניהול איכות המעבדה, הקפדה על חלוקות סבירות ושיפור יכולת הזיהוי של אנשי הצוות, ניתן לצמצם תוצאות שווא עקב פעולות מעבדה לא תקינות.

הסיבות לבדיקה חוזרת חיובית של בדיקת חומצת גרעין SARS-CoV-2 בחולים שהחלימו ומשוחררו

"תוכנית האבחון והטיפול ב-COVID-19 (מהדורה שביעית של ניסוי)" קובעת בבירור שאחד הקריטריונים לריפוי ושחרור של חולי COVID-19 מבית החולים הוא שלשתי דגימות דרכי נשימה עוקבות יש בדיקת חומצה גרעינית שלילית (לפחות בהפרש של 24 שעות), אבל יש מעט מאוד חולי SARS-CoV-2 שהייתה חיובית בבדיקת חומצה גרעינית ששוב הופיעה חיובית בבדיקות גרעיניות שונות.

(1) SARS-CoV-2 הוא וירוס חדש.יש צורך להבין יותר את המנגנון הפתוגני שלה, את התמונה המלאה של המחלה הנגרמת ואת המאפיינים של מהלך המחלה.לכן יש צורך מצד אחד לחזק את ניהול החולים המשוחררים ולערוך השגחה רפואית של 14 יום.לבצע מעקב, ניטור בריאות והכוונה בריאותית להעמקת ההבנה של כל תהליך התרחשות, התפתחות ותוצאת המחלה.

(2) החולה עלול להידבק בנגיף שוב.האקדמיה Zhong Nanshan אמר: מכיוון שלמטופלים שנרפאו יש נוגדנים, ניתן לחסל את SARS-CoV-2 על ידי נוגדנים כאשר הם פולשים שוב.ישנן סיבות רבות, שעשויות להיות הגורם לחולה שהחלים, או שזה עשוי להיות קשור למוטציה של הנגיף, או אפילו הגורם לבדיקות מעבדה.אם זה הנגיף עצמו, המוטציה של SARS-CoV-2 עלולה לגרום לנוגדן המיוצר על ידי החולה שהחלים להיות לא יעיל נגד הנגיף שעבר מוטציה.אם החולה נדבק שוב בנגיף שעבר מוטציה, ייתכן שבדיקת חומצת הגרעין תהיה חיובית שוב.

(3) בכל הנוגע לשיטות בדיקה במעבדה, לכל שיטת בדיקה יש מגבלות.זיהוי חומצות גרעין SARS-CoV-2 נובע מבחירת רצף הגנים, הרכב הריאגנטים, רגישות השיטה וסיבות נוספות, מה שמוביל לערכות הקיימות יש גבולות זיהוי נמוכים משלהן.לאחר הטיפול במטופל, הנגיף בגוף פוחת.כאשר העומס הנגיפי בדגימה לבדיקה נמצא מתחת לגבול הזיהוי התחתון, תופיע תוצאה "שלילית".עם זאת, תוצאה זו אינה אומרת שהנגיף בגוף נעלם לחלוטין.הנגיף עשוי להיות לאחר הפסקת הטיפול.התחדשות", המשך להעתיק.לכן, מומלץ לבצע סקירה אחת לשבוע תוך 2 עד 4 שבועות לאחר השחרור.

(4) חומצת גרעין היא החומר הגנטי של הנגיף.הנגיף נהרג לאחר שהחולה עבר טיפול אנטי-ויראלי, אך שברי ה-RNA הנגיפי הנותרים עדיין נשמרים בגוף האדם, ואינם משתחררים לחלוטין מהגוף.לפעמים, בנסיבות מסוימות, זה יכול להישמר יותר.זמן רב, ובזמן זה בדיקת חומצת הגרעין תהיה חיובית "חולפת".עם הארכת זמן ההחלמה של המטופל, לאחר ששאריות ה-RNA בגוף מותשות בהדרגה, תוצאת בדיקת חומצת הגרעין עלולה להיות שלילית.

(5) תוצאת בדיקת חומצת הגרעין של SARS-CoV-2 מוכיחה רק נוכחות או היעדר RNA ויראלי, ואינה יכולה להוכיח את פעילות הנגיף והאם הנגיף מועבר.יש צורך להוכיח האם מטופל שעבר שוב בדיקת חומצה גרעין חיובית יהפוך שוב למקור זיהום.יש צורך לבצע תרבית וירוס על דגימות קליניות ולטפח וירוס "חי" כדי להוכיח שהוא מדבק.

סיכום

לסיכום, לא ניתן להימנע לחלוטין מבדיקת חומצת גרעין SARS-CoV-2 שליליות כוזבות, חיוביות חוזרות ומצבים אחרים שאינם עולים בקנה אחד עם ביטויים קליניים.בסריקה ובדיקה בפועל, מומלץ לשלב תסמינים קליניים, בדיקות הדמיה (CT) וניסויים תוצאות בדיקת מעבדה (בדיקת חומצות גרעין + בדיקת נוגדנים ספציפיים לנגיף) לאבחון מקיף למניעת אבחנה שגויה ואבחון שגוי.אם נמצא כי תוצאות הבדיקה אינן עולות בקנה אחד עם הביטויים הקליניים, מומלץ לערוך ניתוח מקיף של כל קישור הבדיקה (קישורי איסוף דגימות, מחזור ועיבוד) כדי לא לכלול זיהום מוקדם של נגיף SARS-CoV-2, זיהום חוזר או בשילוב עם זיהומים אחרים של וירוס דרכי הנשימה, וכדומה.אם התנאים מאפשרים זאת, מומלץ לאסוף דגימות רגישות יותר כמו ליחה או נוזל שטיפה מכתשית לבדיקה חוזרת.

מוצרים קשורים:

ערכת זיהוי חומצות גרעין SARS-CoV-2 (שיטת Multiplex PCR Fluorescent Probe)