1. ידע בסיסי (אם אתה רוצה לראות את החלק הניסיוני, אנא העבר ישירות לחלק השני)
כתגובה נגזרת של PCR קונבנציונלי, PCR בזמן אמת עוקב בעיקר אחר השינוי בכמות תוצר ההגברה בכל מחזור של תגובת הגברה של PCR בזמן אמת באמצעות שינוי אות הקרינה, ומנתח כמותית את תבנית ההתחלה דרך הקשר בין ערך ct לעקומה הסטנדרטית.
הנתונים הספציפיים של RT-PCR הםקו בסיס, סף הקרינהוערך Ct.
| קו בסיס: | ערך הקרינה של המחזור ה-3-15 הוא קו הבסיס (בסיס), שנגרם על ידי טעות מדי פעם במדידה. |
| סף (סף): | מתייחס למגבלת זיהוי הקרינה המוגדרת במיקום מתאים באזור הצמיחה האקספוננציאלי של עקומת ההגברה, בדרך כלל פי 10 מסטיית התקן של קו הבסיס. |
| ערך CT: | זהו מספר מחזורי ה-PCR כאשר ערך הקרינה בכל צינור תגובה מגיע לסף. ערך Ct עומד ביחס הפוך לכמות התבנית הראשונית. |
שיטות תיוג נפוצות עבור RT-PCR:
| שיטה | יתרון | חִסָרוֹן | היקף היישום |
| SYBR ירוקⅠ | ישימות רחבה, רגיש, זול ונוח | דרישות הפריימר גבוהות, נוטות ללהקות לא ספציפיות | הוא מתאים לניתוח כמותי של גני מטרה שונים, מחקר על ביטוי גנים ומחקר על בעלי חיים וצמחים רקומביננטיים מהונדסים. |
| TaqMan | ספציפיות טובה ויכולת חזרה גבוהה | המחיר גבוה ומתאים רק למטרות ספציפיות. | איתור פתוגנים, חקר גנים עמידות לתרופות, הערכת יעילות תרופות, אבחון מחלות גנטיות. |
| משואה מולקולרית | סגוליות גבוהה, פלואורסצנטיות, רקע נמוך | המחיר גבוה, מתאים רק למטרה מסוימת, העיצוב קשה והמחיר גבוה. | ניתוח גנים ספציפי, ניתוח SNP |
2. שלבי ניסוי
2.1 על קיבוץ הניסויים- חייבות להיות בארות מרובות בקבוצה, וחייבות להיות חזרות ביולוגיות.
| ① | שליטה ריקה | משמש לזיהוי מצב צמיחת תאים בניסויים |
| ② | siRNA בקרה שלילית (רצף siRNA לא ספציפי) | הדגימו את הספציפיות של פעולת RNAi.siRNA עשויה לגרום לתגובת מתח לא ספציפית בריכוז של 200nM. |
| ③ | בקרת ריאגנטים לטרנספקציה | אל תכלול את הרעילות של מגיב הטרנספקציה לתאים או את ההשפעה על הביטוי של גן המטרה |
| ④ | siRNA נגד גן המטרה | להפיל את הביטוי של גן המטרה |
| ⑤ (אופציונלי) | siRNA חיובי | משמש לפתרון בעיות מערכת ניסיוניות ותפעול |
| ⑥ (אופציונלי) | siRNA בקרת פלורסנט | ניתן לראות את היעילות של העברת תאים באמצעות מיקרוסקופ |
2.2 עקרונות עיצוב פריימר
| גודל מקטע מוגבר | רצוי ב-100-150bp |
| אורך פריימר | 18-25 bp |
| תוכן GC | 30%-70%, רצוי 45%-55% |
| ערך Tm | 58-60℃ |
| סדר פעולות | הימנע מ-T/C מתמשך;A/G רציף |
| רצף 3 סיום | הימנע מ-GC עשיר או AT עשיר;הבסיס הטרמינל הוא רצוי G או C;עדיף להימנע מ-T |
| השלמה | הימנע מרצפים משלימים של יותר מ-3 בסיסים בתוך הפריימר או בין שני פריימרים |
| ספֵּצִיפִיוּת | השתמש בחיפוש פיצוץ כדי לאשר את הספציפיות של פריימר |
①SiRNA הוא ספציפי למין, והרצפים של מינים שונים יהיו שונים.
②SiRNA ארוז באבקה מיובשת בהקפאה, שניתן לאחסן אותה ביציבות למשך 2-4 שבועות בטמפרטורת החדר.
2.3 כלים או ריאגנטים שצריך להכין מראש
| פריימר (התייחסות פנימית) | כולל שניים קדימה ואחורה |
| פריימרים (גן מטרה) | כולל שניים קדימה ואחורה |
| Target Si RNA (3 רצועות) | בדרך כלל, החברה תסנתז 3 רצועות, ולאחר מכן תבחר אחת מהשלוש באמצעות RT-PCR |
| ערכת טרנספקציה | Lipo2000 וכו'. |
| ערכת מיצוי מהירה של RNA | למיצוי RNA לאחר טרנספקציה |
| ערכת תמלול מהיר לאחור | עבור סינתזת cDNA |
| ערכת הגברה של PCR | 2×Super SYBR ירוק qPCR מאסטר מיקס |
2.4 לגבי הנושאים שיש לשים לב אליהם בשלבי הניסוי הספציפיים:
① תהליך טרנספקציה של siRNA
1. לציפוי, אתה יכול לבחור צלחת 24-בארות, צלחת 12-בארות או צלחת 6-בארות (ריכוז ה-RNA הממוצע המוצע בכל באר של צלחת 24-בארות הוא בערך 100-300 ng/uL), וצפיפות הטרנספקציה האופטימלית של תאים היא עד 60%-80% בערך.
2. שלבי ההעברה והדרישות הספציפיות הינם בהתאם להוראות.
3. לאחר טרנספקציה, ניתן לאסוף דגימות תוך 24-72 שעות לזיהוי mRNA (RT-PCR) או זיהוי חלבון תוך 48-96 שעות (WB)
② תהליך מיצוי RNA
1. למנוע זיהום על ידי אנזימים אקסוגניים.זה כולל בעיקר לבישת מסכות וכפפות למהדרין;באמצעות קצות פיפטה מעוקרות וצינורות EP;המים המשמשים בניסוי חייבים להיות ללא RNase.
2. מומלץ לעשות פעמיים כפי שהוצע בערכת החילוץ המהיר, מה שבאמת ישפר את הטוהר והיבול.
3. אסור לפסולת הנוזל לגעת בעמודת ה-RNA.
③ כימות RNA
לאחר חילוץ ה-RNA, ניתן לכמת אותו ישירות עם Nanodrop, והקריאה המינימלית יכולה להיות נמוכה עד 10ng/ul.
④ תהליך תמלול הפוך
1. בשל הרגישות הגבוהה של RT-qPCR, יש ליצור לפחות 3 בארות מקבילות לכל דגימה כדי למנוע מה-Ct שלאחר מכן להיות שונה מדי או שה-SD יהיה גדול מדי לניתוח סטטיסטי.
2. אין להקפיא ולהפשיר מאסטר מיקס שוב ושוב.
3. יש להחליף כל צינור/חור בקצה חדש!אל תשתמש ברציפות באותו קצה פיפטה כדי להוסיף דוגמאות!
4. הסרט המחובר לצלחת 96-בארים לאחר הוספת המדגם צריך להיות מוחלק עם צלחת.עדיף לבצע צנטריפוגה לפני הכנסתו למכונה, כדי שהנוזל שעל דופן הצינור יוכל לזרום למטה ולהסיר בועות אוויר.
⑤ניתוח עקומה נפוצה
| אין תקופה של צמיחה לוגריתמית | אולי ריכוז גבוה של תבנית |
| אין ערך CT | שלבים שגויים לזיהוי אותות פלורסנט; השפלה של פריימרים או בדיקות - ניתן לזהות את שלמותו באמצעות אלקטרופורזה של PAGE; כמות לא מספקת של תבנית; השפלה של תבניות - הימנעות מהחדרת זיהומים והקפאה והפשרה חוזרות ונשנות בהכנת הדגימה; |
| Ct>38 | יעילות הגברה נמוכה;מוצר PCR ארוך מדי;מרכיבי תגובה שונים מתכלים |
| עקומת הגברה לינארית | בדיקות עשויות להתקלקל חלקית על ידי מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים או חשיפה ממושכת לאור |
| ההבדל בין חורים כפולים גדול במיוחד | תמיסת התגובה אינה נמסה לחלוטין או שתמיסת התגובה אינה מעורבת;האמבט התרמי של מכשיר ה-PCR מזוהם על ידי חומרים פלורסנטים |
2.5 על ניתוח נתונים
ניתן לחלק את ניתוח הנתונים של qPCR לכימות יחסי וכימות מוחלט.לדוגמה, תאים בקבוצת הטיפול בהשוואה לתאים בקבוצת הביקורת,
כמה פעמים ה-mRNA של הגן X משתנה, זהו כימות יחסי;במספר מסוים של תאים, ה-mRNA של הגן X
כמה עותקים יש, זה כימות מוחלט.בדרך כלל מה שאנחנו משתמשים הכי הרבה במעבדה היא השיטה הכמותית היחסית.בְּדֶרֶך כְּלַל,שיטת 2-ΔΔctמשמש הכי הרבה בניסויים, אז רק שיטה זו תוצג בפירוט כאן.
שיטת 2-ΔΔct: התוצאה המתקבלת היא ההבדל בביטוי גן המטרה בקבוצת הניסוי ביחס לגן המטרה בקבוצת הביקורת.נדרש כי יעילות ההגברה הן של גן המטרה והן של גן ההתייחסות הפנימי תהיה קרובה ל-100%, והסטייה היחסית לא תעלה על 5%.
שיטת החישוב היא כדלקמן:
קבוצת ביקורת Δct = ערך ct של גן המטרה בקבוצת ביקורת – ערך ct של גן ייחוס פנימי בקבוצת ביקורת
קבוצת ניסוי Δct = ערך ct של גן המטרה בקבוצת הניסוי – ערך ct של גן הייחוס הפנימי בקבוצת הניסוי
ΔΔct=Δct קבוצת ניסוי-Δct קבוצת ביקורת
לבסוף, חשב את מכפיל ההבדל ברמת הביטוי:
Change Fold=2-ΔΔct (המתאים לפונקציית האקסל היא POWER)
מוצרים קשורים:
זמן פרסום: 20 במאי 2023
