一、הגברת הרגישות של מערכת התגובה:

1. לבודד RNA באיכות גבוהה:

סינתזת cDNA מוצלחת מגיעה מ-RNA באיכות גבוהה.RNA באיכות גבוהה צריך להיות לפחות באורך מלא וללא מעכבי טרנסקריפטאז הפוך כגון EDTA או SDS.איכות ה-RNA קובעת את הכמות המקסימלית של מידע רצף שתוכלו לתמלל ל-cDNA.שיטת טיהור RNA נפוצה היא שיטה חד-שלבית באמצעות גואנידין איזותיוציאנט/פנול חומצה.כדי למנוע זיהום על ידי כמויות עקבות של RNase, RNA שבודד מדגימות עשירות ב-RNase (כגון לבלב) צריך להיות מאוחסן בפורמלדהיד כדי לשמר RNA באיכות גבוהה, במיוחד לאחסון לטווח ארוך.ה-RNA שהופק מכבד החולדות התפרק בעצם לאחר אחסון במים למשך שבוע, בעוד שה-RNA המופק מטחול החולדות נשאר יציב לאחר אחסון במים במשך 3 שנים.בנוסף, תמלילים ארוכי מ-4 kb רגישים יותר לפירוק על ידי עקבות RNases מאשר תמלילים קטנים.כדי להגביר את היציבות של דגימות RNA מאוחסנות, ניתן להמיס RNA בפורמאמיד מפושט ולאחסן ב-70 מעלות צלזיוס.פורמאמיד המשמש לשימור RNA חייב להיות נקי מפסולת מפרקת RNA.RNA מהלבלב יכול להישמר בפורמאמיד למשך שנה אחת לפחות.בעת הכנה לשימוש ב-RNA, אתה יכול להשתמש בשיטה הבאה כדי לזרז RNA: הוסף NaCl ל-0.2M ופי 4 מנפח האתנול, הנח בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות, וצנטריפוגה ב-10,000×g למשך 5 דקות.

2. השתמש בתעתיק הפוך של RNaseH-לא פעיל (RNaseH-):

מעכבי RNase מתווספים לעתים קרובות לתגובות שעתוק הפוכה כדי להגדיל את האורך והתפוקה של סינתזת cDNA.יש להוסיף מעכבי RNase במהלך תגובת סינתזת הגדיל הראשון בנוכחות חוצץ וחומר מפחית (כגון DTT), מכיוון שהתהליך שלפני סינתזת cDNA מעכב את המעכב, ובכך משחרר RNase קשור שיכול לפרק RNA.מעכבי RNase חלבון מונעים רק את הפירוק של RNA על ידי RNase A, B, C, ואינם מונעים RNase על העור, לכן היזהר לא להחדיר RNase מהאצבעות למרות השימוש במעכבים אלו.

Transcriptase הפוך מזרז את ההמרה של RNA ל-cDNA.גם ל-M-MLV וגם ל-AMV יש פעילות RNaseH אנדוגנית בנוסף לפעילות הפולימראז שלהם.פעילות RNaseH ופעילות פולימראז מתחרות ביניהן על הגדיל ההיברידי שנוצר בין תבנית ה-RNA לבין פריימר ה-DNA או גדיל ההארכה של cDNA, ומפרקים את גדיל ה-RNA בקומפלקס RNA:DNA.תבנית ה-RNA המפורקת על ידי פעילות RNaseH אינה יכולה עוד לשמש כמצע יעיל לסינתזת cDNA, מה שמפחית את התפוקה ואת אורך סינתזת ה-cDNA.לכן, זה יהיה מועיל לחסל או להפחית במידה ניכרת את פעילות RNaseH של תעתיק הפוך..

SuperScript Ⅱ transcriptase הפוך, RNaseH- MMLV transcriptase הפוך ותעתוק הפוך של thermoScript, RNaseH-AMV, יכולים להשיג יותר כמות ויותר cDNA באורך מלא מאשר MMLV ו-AMV.רגישות RT-PCR תושפע מכמות סינתזת ה-cDNA.ThermoScript הרבה יותר רגיש מ-AMV.הגודל של מוצרי RT-PCR מוגבל על ידי היכולת של תעתיק הפוך לסנתז cDNA, במיוחד בעת שיבוט cDNA גדולים יותר.בהשוואה ל-MMLV, SuperScripⅡ הגדיל משמעותית את התשואה של מוצרי RT-PCR ארוכים.ל-RNaseH-reverse transcriptase יש גם יציבות תרמוסית מוגברת, כך שניתן לבצע את התגובה בטמפרטורות גבוהות מהרגיל של 37-42 מעלות צלזיוס.בתנאי הסינתזה המוצעים, השתמש בפריימר oligo(dT) וב-10 μCi של [α-P]dCTP.התשואה הכוללת של הגדיל הראשון חושבה באמצעות שיטת המשקעים TCA.cDNA באורך מלא נותח באמצעות פסים ממוינים בגודל שנכרתו ונספרו על ג'ל אגרוז אלקליין.

3. העלה את טמפרטורת הדגירה לתעתוק הפוך:

טמפרטורת דגירה גבוהה יותר עוזרת לפתוח את המבנה המשני של ה-RNA, להגדיל את תפוקת התגובה.עבור רוב תבניות ה-RNA, דגירה של ה-RNA והפריימרים ב-65 מעלות צלזיוס ללא חיץ או מלח, ולאחר מכן קירור מהיר על קרח יבטל את רוב המבנים המשניים ויאפשר לקשור פריימרים.עם זאת, לחלק מהתבניות עדיין יש מבנים משניים, גם לאחר דנטורציה בחום.ניתן לבצע הגברה של תבניות קשות אלו באמצעות ThermoScript Reverse Transcriptase והצבת תגובת השעתוק ההפוכה בטמפרטורה גבוהה יותר כדי לשפר את ההגברה.טמפרטורות דגירה גבוהות יותר יכולות גם להגביר את הספציפיות, במיוחד כאשר משתמשים בפריימרים ספציפיים לגנים (GSP) לסינתזה של cDNA (ראה פרק 3).אם משתמשים ב-GSP, ודא שה-Tm של הפריימרים זהה לטמפרטורת הדגירה הצפויה.אין להשתמש ב-oligo(dT) ובפריימרים אקראיים מעל 60°C.פריימרים אקראיים דורשים דגירה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני העלייה ל-60 מעלות צלזיוס.בנוסף לשימוש בטמפרטורת שעתוק הפוך גבוהה יותר, ניתן לשפר את הספציפיות גם על ידי העברה ישירה של תערובת ה-RNA/פריימר מטמפרטורת הדנטורציה של 65 מעלות צלזיוס לטמפרטורת הדגירה של שעתוק הפוך והוספת תערובת תגובה מחוממת מראש של 2× (סינתזת התחלה חמה של cDNA).גישה זו עוזרת למנוע את זיווג הבסיסים הבין-מולקולרי המתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר.ניתן לפשט את החלפת הטמפרטורה המרובה הנדרשת עבור RT-PCR על ידי שימוש במחזור תרמי.

Tth פולימראז תרמי פועל כפולימראז DNA בנוכחות Mg2+ וכפולימראז RNA בנוכחות Mn2+.ניתן לשמור על חום בטמפרטורה מקסימלית של 65 מעלות צלזיוס.עם זאת, הנוכחות של Mn2+ במהלך PCR מפחיתה את הנאמנות, מה שהופך את הפולימראז של Tth לפחות מתאים להגברה ברמת דיוק גבוהה, כגון שיבוט של cDNA.בנוסף, ל-Tth יעילות שעתוק הפוך נמוכה, מה שמפחית רגישות, ומכיוון שניתן לבצע שעתוק הפוך ו-PCR עם אנזים בודד, לא ניתן להשתמש בתגובות בקרה ללא שעתוק הפוך כדי להשוות בין מוצרי הגברה של cDNA עם DNA גנומי מזהם.תוצרי ההגברה הופרדו.

4. תוספים המקדמים תמלול הפוך:

תוספות כולל גליצרול ו-DMSO מתווספים לתגובת סינתזת הגדיל הראשון, מה שיכול להפחית את היציבות של החומצה הכפולה של חומצת הגרעין ולהתיר את המבנה המשני של ה-RNA.ניתן להוסיף עד 20% גליצרול או 10% DMSO מבלי להשפיע על פעילות SuperScript II או MMLV.AMV יכול גם לסבול עד 20% גליצרול ללא אובדן פעילות.על מנת למקסם את הרגישות של RT-PCR בתגובת השעתוק ההפוכה SuperScriptⅡ, ניתן להוסיף 10% גליצרול ולהדגר ב-45 מעלות צלזיוס.אם מוסיפים ל-PCR 1/10 מתוצר התגובה לשעתוק הפוכה, אזי ריכוז הגליצרול בתגובת ההגברה הוא 0.4%, וזה לא מספיק כדי לעכב PCR.

5. טיפול ב-RNaseH:

טיפול בתגובות סינתזה של cDNA עם RNaseH לפני PCR יכול להגביר את הרגישות.עבור תבניות מסוימות, נהוג לחשוב ש-RNA בתגובת סינתזה של cDNA מונע את הקישור של מוצרי הגברה, ובמקרה זה טיפול ב-RNaseH יכול להגביר את הרגישות.בדרך כלל, טיפול ב-RNaseH הכרחי בעת הגברה של תבניות יעד ארוכות יותר באורך מלא של cDNA, כגון שחפת II בעותק נמוך.עבור תבנית קשה זו, טיפול ב-RNaseH שיפר את האות המופק על ידי SuperScript II או cDNA מסונתז של AMV.עבור רוב תגובות RT-PCR, טיפול ב-RNaseH הוא אופציונלי, מכיוון ששלב הדנטורציה של PCR ב-95°C בדרך כלל מבצע הידרוליזה של ה-RNA בקומפלקס ה-RNA:DNA.

6. שיפור שיטת זיהוי RNA קטן:

RT-PCR הוא מאתגר במיוחד כאשר רק כמויות קטנות של RNA זמינות.גליקוגן המוסף כנשא במהלך בידוד RNA עוזר להגדיל את התשואה של דגימות קטנות.ניתן להוסיף גליקוגן נטול RNase במקביל להוספת Trizol.הגליקוגן מסיס במים וניתן לשמור אותו בשלב המימי עם RNA כדי לסייע במשקעים הבאים.עבור דגימות של פחות מ-50 מ"ג של רקמה או 106 תאים בתרבית, הריכוז המומלץ של גליקוגן נטול RNase הוא 250 מיקרוגרם/מ"ל.

הוספת BSA עם אצטילציה לתגובת השעתוק ההפוכה באמצעות SuperScript II יכולה להגביר את הרגישות, ועבור כמויות קטנות של RNA, הפחתת כמות ה-SuperScript II והוספת 40 יחידות של מעכב נוקלאז RNaseOut יכולה להגביר את רמת הזיהוי.אם נעשה שימוש בגליקוגן בתהליך בידוד RNA, עדיין מומלץ להוסיף BSA או RNase inhibitor בעת שימוש ב-SuperScript II לתגובת שעתוק הפוכה.

二、הגדל את הספציפיות של RT-PCR

1. אסינתזה של CND:

ניתן להתחיל סינתזת cDNA של גדיל ראשון באמצעות שלוש שיטות שונות, שהספציפיות היחסית שלהן משפיעה על כמות וסוג ה-cDNA המסונתז.

שיטת הפריימר האקראי הייתה הפחות ספציפית מבין שלוש השיטות.פריימרים מתערפלים במספר אתרים לאורך התמלול, ומייצרים cDNA קצרים באורך חלקי.שיטה זו משמשת לעתים קרובות להשגת רצפי קצה של 5′ ולהשגת cDNA מתבניות RNA עם אזורים במבנה משני או עם אתרי סיום שלא ניתן לשכפל על ידי תעתיק הפוך.כדי להשיג את ה-cDNA הארוך ביותר, היחס בין פריימרים ל-RNA בכל דגימת RNA צריך להיקבע באופן אמפירי.הריכוז ההתחלתי של פריימרים אקראיים נע בין 50 ל-250 ng לכל תגובה של 20 μl.מכיוון ש-cDNA המסונתז מ-RNA הכולל באמצעות פריימרים אקראיים הוא בעיקר RNA ריבוזומלי, פולי(A)+RNA נבחר בדרך כלל כתבנית.

פריימרים Oligo(dT) ספציפיים יותר מפריימרים אקראיים.זה הכלאה לזנב הפולי(A) שנמצא בקצה 3' של רוב ה-mRNA האוקריוטיים.מכיוון ש-poly(A)+ RNA הוא כ-1% עד 2% מסך ה-RNA, הכמות והמורכבות של cDNA נמוכה בהרבה מאשר עם פריימרים אקראיים.בגלל הספציפיות הגבוהה שלו, אוליגו(dT) בדרך כלל אינו דורש אופטימיזציה של היחס בין RNA לפריימרים ובחירת poly(A)+.מומלץ להשתמש ב-0.5μg oligo(dT) לכל מערכת תגובה של 20μl.oligo(dT)12-18 מתאים לרוב RT-PCR.מערכת ThermoScript RT-PCR מציעה oligo(dT)20 בגלל היציבות התרמית הטובה יותר שלה לטמפרטורות דגירה גבוהות יותר.

פריימרים ספציפיים לגנים (GSP) הם הפריימרים הספציפיים ביותר לשלב השעתוק ההפוך.GSP הוא אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס שיכול לבצע הכלאה ספציפית לרצף היעד של ה-RNA, שלא כמו פריימרים אקראיים או אוליגו(dT), המתלכדים לכל ה-RNA.אותם כללים המשמשים לעיצוב פריימרים של PCR חלים על העיצוב של GSP בתגובות שעתוק הפוכה.ה-GSP יכול להיות זהה לרצף של פריימר ההגברה המתלכד לקצה ה-3' ביותר של ה-mRNA, או שה-GSP יכול להיות מתוכנן כך שיכליל במורד הזרם של פריימר ההגברה הפוכה.עבור חלק מהנבדקים המוגברים, יש לתכנן יותר מפריימר אנטי-סנס אחד ל-RT-PCR מוצלח מכיוון שהמבנה המשני של RNA היעד עשוי למנוע קישור פריימר.מומלץ להשתמש ב-1 pmol antisense GSP בתגובת סינתזה של גדיל ראשון של 20 μl.

2. העלה את טמפרטורת הדגירה לתעתוק הפוך:

על מנת לנצל את מלוא היתרון של הספציפיות של GSP, יש להשתמש ב- transcriptase הפוכה עם יציבות תרמוסית גבוהה יותר.ניתן להחדיר תעתיקים הפוכים עמידים בחום בטמפרטורות גבוהות יותר כדי להגביר את קשיחות התגובה.לדוגמה, אם GSP מחשל ב-55 מעלות צלזיוס, הספציפיות של ה-GSP לא תנוצל במלואה אם ​​נעשה שימוש ב-AMV או M-MLV לשעתוק הפוך במחמירות נמוכה של 37°C.עם זאת, ניתן להגיב ל-SuperScript II ו-ThermoScript ב-50°C ומעלה, מה שיבטל מוצרים לא ספציפיים שנוצרו בטמפרטורות נמוכות יותר.לספציפיות מקסימלית, ניתן להעביר את תערובת ה-RNA/פריימר ישירות מטמפרטורת הדנטורציה של 65 מעלות צלזיוס לטמפרטורת הדגירה של שעתוק הפוך ולהוסיף לתערובת תגובה מחוממת מראש של 2× (התחלה חמה של סינתזת cDNA).זה עוזר למנוע זיווג בסיסים בין-מולקולרי בטמפרטורות נמוכות.ניתן לפשט את מעברי הטמפרטורה המרובים הנדרשים ל-RT-PCR על ידי שימוש במחזור תרמי.

3. מפחית זיהום DNA גנומי:

קושי פוטנציאלי שנתקל ב-RT-PCR הוא זיהום ה-DNA הגנומי ב-RNA.שימוש בשיטת בידוד RNA טובה, כגון Trizol Reagent, יקטין את כמות ה-DNA הגנומי המזהם את תכשיר ה-RNA.כדי להימנע ממוצרים שמקורם ב-DNA גנומי, ניתן לטפל ב-RNA עם DNase I בדרגת הגברה כדי להסיר DNA מזהם לפני שעתוק הפוך.העיכול של DNase I הופסק על ידי דגירה של הדגימות ב-2.0 mM EDTA למשך 10 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.EDTA יכול להכיל יוני מגנזיום, ולמנוע הידרוליזה של RNA תלוי יוני מגנזיום בטמפרטורות גבוהות.

על מנת להפריד בין cDNA מוגבר ממוצרי הגברה גנומיים מזהמים של DNA, ניתן לעצב פריימרים שכל אחד מהם מחשל להפרדת אקסונים.מוצרי PCR שמקורם ב-cDNA יהיו קצרים יותר מאלה שמקורם ב-DNA גנומי מזוהם.בנוסף, בוצע ניסוי בקרה ללא שעתוק הפוך על כל תבנית RNA כדי לקבוע אם מקטע נתון נגזר מ-DNA גנומי או cDNA.תוצר ה-PCR המתקבל ללא שעתוק הפוך נגזר מהגנום.