• פייסבוק
  • לינקדאין
  • יוטיוב

כמה המצאות מהפכניות בהיסטוריה של טכנולוגיית הזיהוי בעיניי הן טכנולוגיית אימונוולציה המבוססת על עקרון הקישור הספציפי לאנטיגן-נוגדנים, טכנולוגיית PCR וטכנולוגיית רצף.היום נדבר על טכנולוגיית PCR.על פי האבולוציה של טכנולוגיית PCR, אנשים נוהגים לחלק את טכנולוגיית PCR לשלושה דורות: טכנולוגיית PCR רגילה, טכנולוגיית PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת וטכנולוגיית PCR דיגיטלית.

Cטכניקת PCR ommon

w1

KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)

קארי מוליס המציא את תגובת השרשרת של הפולימראז (תגובת שרשרת פולימראז, PCR) בשנת 1983. אומרים שכאשר נהג בחברתו, פתאום היה לו הבזק של השראה וחשב על העיקרון של PCR (על יתרונות הנהיגה).קארי מוליס זכתה בפרס נובל לכימיה בשנת 1993. ה"ניו יורק טיימס" הגיב: "מקורי ומשמעותי ביותר, כמעט מחלק את הביולוגיה לתקופות טרום-PCR ופוסט-PCR.

עיקרון ה-PCR: תחת קטליזה של DNA פולימראז, ה-DNA של גדיל האם משמש כתבנית, והפריימר הספציפי משמש כנקודת ההתחלה של הארכה, וה-DNA של גדיל הבת המשלים ל-DNA של תבנית גדיל האם מועתק במבחנה באמצעות דנטורציה, חישול, הארכה ועוד שלבים.זוהי טכנולוגיית הגברה של סינתזת DNA במבחנה, שיכולה להגביר במהירות ובאופן ספציפי כל DNA מטרה במבחנה.

w2

היתרונות של PCR רגיל
1.שיטה קלאסית, סטנדרטים בינלאומיים ומקומיים מלאים
2.עלות נמוכה יותר של ריאגנטים למכשיר
3.ניתן לשחזר מוצרי PCR עבור ניסויים אחרים בביולוגיה מולקולרית
מכונת PCR מומלצת של Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
מוצרים קשורים: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
חסרונות של PCR רגיל
1.קל לזהם
2.פעולה מסורבלת
3.רק ניתוח איכותי
4.רגישות בינונית
5.יש הגברה לא ספציפית, וכאשר הרצועה הלא ספציפית זהה לרצועת היעד, לא ניתן להבחין בה
 
CPCR מבוסס אלקטרופורזה אפילרית
בתגובה לחסרונות של PCR רגיל, חלק מהיצרנים הציגו מכשירים המבוססים על העיקרון של אלקטרופורזה נימית.שלב האלקטרופורזה לאחר הגברת PCR הושלם בנימי.הרגישות גבוהה יותר, וניתן להבחין בהבדל של מספר בסיסים ולחשב את ההגברה על ידי MAERKER.תוכן המוצר.החיסרון הוא שמוצר ה-PCR עדיין צריך להיפתח ולהכניס למכשיר, ועדיין קיים סיכון גדול לזיהום.

w3

CאפילריEלקטרופורזה

 

2. טכנולוגיית PCR כמותי פלואורסצנטי (Quantitative Real-Time PCR, qPCR) בזמן אמתPCR כמותי פלואורסצנטי, המכונה גם PCR בזמן אמת, היא טכנולוגיה כמותית חדשה של חומצת גרעין שפותחה על ידי PE (Perkin Elmer) בשנת 1995. היסטוריית הפיתוח של PCR כמותי פלואורסצנטי היא היסטוריה של מאבקים מעוררי נפש של ענקים כמו ABI, Roche וביו-רד.אם אתה מעוניין, אתה יכול לבדוק את זה.טכניקה זו היא כיום טכניקת ה-PCR החצי-כמותית הבוגרת והנפוצה ביותר.

מכונת qPCR מומלצת: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

שיטת צבע פלואורסצנטי (SYBR Green I):SYBR Green I הוא הצבע הקושר ל-DNA הנפוץ ביותר עבור PCR כמותי, הנקשר באופן לא ספציפי ל-DNA דו-גדילי.במצב חופשי, SYBR Green פולט פלואורסצנטי חלש, אך ברגע שהוא נקשר ל-DNA דו-גדילי, הקרינה שלו עולה פי 1000.לכן, סך האות הפלורסנט הנפלט מתגובה הוא פרופורציונלי לכמות ה-DNA הדו-גדילי הקיים ויגדל עם הגידול של המוצר המוגבר.מכיוון שהצבע נקשר באופן לא ספציפי ל-DNA דו-גדילי, עלולות להיווצר תוצאות חיוביות שגויות.

מוצרים קשורים: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

שיטת בדיקה פלורסנטית (טכנולוגיית טקמן): במהלךהגברה של PCR, בדיקה פלורסנטית ספציפית מתווספת במקביל לזוג פריימרים.הבדיקה היא אוליגונוקלאוטיד ליניארי, עם קבוצת מדווח פלואורסצנטי וקבוצת מרווה ניאון מסומנים בהתאמה בשני הקצוות.כאשר הגשושית שלמה, האות הפלורסנט הנפלט על ידי קבוצת הכתבים נספג על ידי קבוצת המרווה, והזיהוי אין אות פלואורסצנטי;במהלך הגברה של PCR (בשלב ההרחבה), פעילות 5'-3' Dicer של האנזים Taq תעכל ותפרק את הגשש, כך שקבוצת הפלורסנט הכתב וקבוצת הפלורסנט המרווה יופרדו, כך שמערכת ניטור הקרינה ניתן לקלוט את האות הפלואורסצנטי, כלומר בכל פעם ששרשרת ה-DNA מצטברת את המולקולה המלאה של ה-DNA המוגברת, אשר מצטברת את המולקולה המלאה של ה-DNA. יצירת אותות ניאון ויצירת תוצרי PCR.שיטת הבדיקה של טקמן היא שיטת הזיהוי הנפוצה ביותר בגילוי קליני.

מוצרים קשורים: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

היתרונות של qPCR
1.השיטה בשלה והציוד התומך והריאגנטים שלמים
2.עלות בינונית של ריאגנטים
3.קל לשימוש
4.רגישות וסגוליות זיהוי גבוהות
 
החסרונות של qPCR

המוטציה של גן המטרה מובילה לזיהוי החמצה.
לא ניתן לקבוע את תוצאת הזיהוי של תבנית בריכוז נמוך.
קיימת שגיאה גדולה בעת שימוש בעקומה הסטנדרטית לזיהוי כמותי.
 
3. טכנולוגיית PCR דיגיטלית (דיגיטל PCR, dPCR).
PCR דיגיטלי היא טכניקה לכימות מוחלטת של מולקולות חומצת גרעין.בהשוואה ל-qPCR, PCR דיגיטלי יכול לקרוא ישירות את מספר מולקולות ה-DNA/RNA, שהוא הכימות המוחלט של מולקולות חומצת הגרעין בדגימת המוצא.בשנת 1999 הציעו ברט פוגלשטיין וקנת וו. קינזלר רשמית את המושג dPCR.
 
בשנת 2006, Fluidigm הייתה הראשונה לייצר מכשיר dPCR מסחרי מבוסס שבב.בשנת 2009 השיקה Life Technologies את מערכות OpenArray ו-QuantStudio 12K Flex dPCR.בשנת 2013 השיקה לייף טכנולוגיות את מערכת QuantStudio 3DdPCR, המשתמשת בטכנולוגיית שבבים מיקרו-נוזליים בצפיפות גבוהה כדי לפזר דגימות באופן שווה ל-20,000 תאים בודדים.בתגובה היטב.

w5

בשנת 2011 השיקה ביו-רד את מכשיר QX100 dPCR מבוסס טיפות, המשתמש בטכנולוגיית מים-בשמן לפיזור שווה של הדגימה ל-20,000 טיפות-מים-בשמן, ומשתמש בנתח טיפות כדי לנתח את הטיפות.בשנת 2012 השיקה RainDance את מכשיר ה-RainDrop dPCR, המונע על ידי גז בלחץ גבוה, כדי לחלק כל מערכת תגובה סטנדרטית לאמולסיית תגובה המכילה 1 מיליון עד 10 מיליון טיפות מיקרו ברמת פיקוליטר.

w6

עד כה, PCR דיגיטלי יצר שני פלגים עיקריים, סוג שבב וסוג טיפה.לא משנה איזה סוג של PCR דיגיטלי, עקרונות הליבה שלו הם הגבלת דילול, PCR נקודת קצה והפצת Poisson.מערכת ריאקציית PCR הסטנדרטית המכילה תבניות חומצות גרעין מחולקת באופן שווה לעשרות אלפי תגובות PCR, המופצות לצ'יפים או מיקרוטיפות, כך שכל תגובה מכילה ככל האפשר מולקולת תבנית, ומבוצעת תגובת PCR של תבנית אחת של מולקולה אחת.על ידי קריאת הקרינה הנוכחות או היעדר האות נספרת, והכימות המוחלט מתבצע לאחר כיול של התפלגות הפואסון הסטטיסטית.

להלן המאפיינים של מספר פלטפורמות PCR דיגיטליות בהן השתמשתי:

1. Bio-Rad QX200 טיפת PCR דיגיטלי Bio-RadQX200 היא פלטפורמת PCR דיגיטלית קלאסית מאוד, תהליך הזיהוי הבסיסי: 20,000 דגימות נוצרות על ידי מחולל הטיפות מיקרו טיפות מים בשמן מוגברות במכונת PCR רגילה, ולבסוף אות הקרינה של כל מיקרו טיפה נקרא על ידי קורא מיקרו טיפות.הפעולה מסובכת יותר, והסיכון לזיהום בינוני.

w7

Xinyi TD1 מיקרו-טיפות PCR דיגיטליXinyi TD1 היא פלטפורמת PCR דיגיטלית ביתית, תהליך הזיהוי הבסיסי: הפקת 30,000-50,000 טיפות מים בשמן באמצעות מחולל טיפות, הגברה במכשיר PCR נפוץ, ולבסוף עוברת קורא הטיפות קורא את אות הפלורסנט של כל טיפה.גם יצירת טיפות וגם קריאה בפלטפורמה זו מתבצעים בשבב ייעודי עם סיכון נמוך לזיהום.

w8

 STILLA Naica PCR דיגיטלי שבב מיקרו טיפותSTILLA Naica היא פלטפורמת PCR דיגיטלית חדשה יחסית.תהליך הזיהוי הבסיסי הוא: הוספת תמיסת התגובה לשבב, הכנסת השבב למערכת היצירה וההגברה של מיקרו-טיפות ויצירת 30,000 מיקרו-טיפות.מורחים על השבב, והגברת PCR הושלמה על השבב.לאחר מכן השבב המוגבר מועבר למערכת ניתוח קריאת המיקרו-טיפות, והאות הפלורסנט נקרא על ידי צילום תמונות.מכיוון שכל התהליך מתרחש בשבב סגור, הסיכון לזיהום נמוך.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D שבב דיגיטלי PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D היא עוד פלטפורמת PCR דיגיטלית קלאסית מבוססת שבבים.תהליך הזיהוי הבסיסי שלו הוא: הוסף את תמיסת התגובה לתוך המפזר, ופזר את תמיסת התגובה באופן שווה על השבב עם 20,000 microwells דרך המפזר., הניחו את השבב על מכונת ה-PCR כדי להגביר, ולבסוף הכניסו את השבב לקורא וצלמו לקריאת אות הפלורסנט.הפעולה מורכבת יחסית, וכל התהליך מתבצע בשבב סגור, והסיכון לזיהום נמוך.

w10

5. PCR דיגיטלי בשבב JN MEDSYS Clarity

JN MEDSYS Clarity היא פלטפורמת PCR דיגיטלית חדשה יחסית מסוג שבב.תהליך הזיהוי הבסיסי שלו הוא: הוסף את תמיסת התגובה לתוך המוליך, ופזר את תמיסת התגובה באופן שווה על 10,000 צינורות PCR קבועים בצינור PCR דרך המוליך.בשבב המיקרו-נקבי, תמיסת התגובה נכנסת לשבב באמצעות פעולה נימית, וצינור ה-PCR עם השבב מונח על מכונת ה-PCR להגברה, ולבסוף מכניסים את השבב לקורא כדי לקרוא את אות הפלורסנט על ידי צילום.הפעולה מסובכת יותר.הסיכון לזיהום נמוך.

w11

הפרמטרים של כל פלטפורמת PCR דיגיטלית מסוכמים כדלקמן:

w12

מדדי ההערכה של פלטפורמת ה-PCR הדיגיטלית הם: מספר היחידות המפוצלות, מספר תעלות הפלורסנט, מורכבות הפעולה והסיכון לזיהום.אבל הדבר החשוב ביותר הוא דיוק הזיהוי.דרך אחת להעריך פלטפורמות PCR דיגיטליות היא להשתמש במספר פלטפורמות PCR דיגיטליות כדי לאמת אחת את השנייה, ודרך אחרת היא להשתמש בחומרים סטנדרטיים עם ערכים מדויקים.

היתרונות של dPCR
1.השגת כימות מוחלט
2.רגישות וסגוליות גבוהות יותר
3.יכול לזהות דגימות עותק נמוכות
חסרונות של dPCR1. ציוד וריאגנטים יקרים 2. פעולה מסובכת וזמן זיהוי ארוך 3. טווח זיהוי צר

נכון להיום, לשלושת הדורות של טכנולוגיית ה-PCR יש יתרונות וחסרונות משלהם, ולכל אחד תחומי יישום משלו, ואין זה קשר שדור אחד מחליף את השני.ההתקדמות המתמשכת של הטכנולוגיה החדירה חיוניות חדשה לטכנולוגיית PCR, ומאפשרת לה לפתוח כיוון יישום אחד אחרי השני, מה שהופך את זיהוי חומצות הגרעין לנוח ומדויק יותר.
מקור: ד"ר יואן לוקח אותך לבדיקה
 
מוצרים מומלצים:


זמן פרסום: 18 בנובמבר 2022