1. לזהות את הספיגה של תמיסת RNA
ספיגה ב-280, 320, 230 ו-260 ננומטר מייצגת את הערכים של חומצת גרעין, רקע (עכירות בתמיסה), ריכוז מלח וחומרים אורגניים כגון חלבון, בהתאמה.בדרך כלל מסתכלים רק על OD260/OD280 (יחס, R).כאשר 1.8 ~ 2.0, אנו חושבים שניתן לסבול את הזיהום של חלבון או חומר אורגני אחר ב-RNA, אך יש לציין שכאשר Tris משמש כמאגר לזיהוי הספיגה, ערך R עשוי להיות גדול מ-2 (בדרך כלל הוא צריך להיות <2.2).כאשר R<1.8, זיהום החלבון או חומר אורגני אחר בתמיסה ברור יותר, וניתן לקבוע את גורל ה-RNA בהתאם לצרכים.כאשר R>2.2, זה אומר ש-RNA עבר הידרוליזה לחומצת גרעין בודדת.
2. דפוס אלקטרופורטי של RNA
בדרך כלל, ג'ל דנטורציה משמש לאלקטרופורזה של RNA, אבל אם זה רק לזיהוי איכות ה-RNA, אין צורך בג'ל דנטורציה וניתן להשתמש בג'ל אגרוז רגיל.מטרת האלקטרופורזה היא לזהות את שלמות רצועות 28S ו-18S ואת היחס ביניהן, או את שלמות מריחת ה-mRNA.באופן כללי, אם רצועות ה-28S וה-18S בהירות, ברורות וחדות (הכוונה לכך שקצוות הרצועות ברורים), והבהירות של 28S היא יותר מפי שניים מזו של רצועת ה-18S, אנו מחשיבים את איכות ה-RNA כטובה.
האמור לעיל הן שתי השיטות בהן אנו משתמשים בדרך כלל, אך אף אחת משתי השיטות הללו לא יכולה לומר לנו בבירור אם יש שאריות של RNase בתמיסת ה-RNA.אם יש בתמיסה כמות קטנה מאוד של RNase, קשה לנו לזהות אותה בשיטה הנ"ל, אבל רוב התגובות האנזימטיות הבאות מתבצעות במעל 37 מעלות ולאורך זמן רב.בדרך זו, אם יש כמות קטנה מאוד של RNase בתמיסת ה-RNA, אז תהיה סביבה וזמן מתאים מאוד למלא את תפקידם בניסויים הבאים, וכמובן שהניסוי יהיה קר בזמן זה.להלן אנו מציגים שיטה שיכולה לאשר אם יש שאריות של RNase בתמיסת ה-RNA.
3. בדיקת שימור חום
לפי ריכוז הדגימה, שואבים שני RNA של 1000 ng מתמיסת ה-RNA ומוסיפים אותו לשפופרת צנטריפוגה של 0.5 מ"ל, ומשלימים אותו עם pH 7.0 Tris buffer לנפח כולל של 10 ul, ולאחר מכן אטום את מכסה הצינור.הכניסו אחד מהם לאמבט מים בטמפרטורה קבועה ב-70 מעלות צלזיוס והשאירו אותו חם למשך שעה.החלק השני אוחסן במקרר -20 מעלות צלזיוס למשך שעה.כשנגמר הזמן, הסר את שתי הדגימות לאלקטרופורזה.לאחר השלמת האלקטרופורזה, השווה את הרצועות האלקטרופורטיות של השתיים.אם הרצועות של השתיים עקביות או שאין להן הבדל משמעותי (כמובן שגם הרצועות שלהן עומדות בתנאים בשיטה 2), זה אומר שאין זיהום RNase שיורי בתמיסת ה-RNA, ואיכות ה-RNA טובה מאוד.להיפך, אם הדגימה שהודגרה ב-70 מעלות צלזיוס מראה השפלה ברורה, זה מצביע על כך שיש זיהום RNase בתמיסת ה-RNA.
2 שיטות וטכניקות ניסוי למיצוי RNA
הבעיות שאנו נתקלים בהן לעתים קרובות בעת מיצוי RNA הן: (1) תפוקת ה-RNA נמוכה;(2) ל-RNA יש זיהום מלח רציני;(3) ל-RNA יש זיהום ממס אורגני רציני;(4) השפלה מדגם ובעיות אחרות
1. ריאגנטים למיצוי RNA הכוללים בשימוש נפוץ
שיטת ה-Guanidine Isothiocyanate ושיטת Trizol הן השיטות הנפוצות ביותר למיצוי RNA כולל מרקמות בעלי חיים ותאי בעלי חיים.הוא מתאים במיוחד לדגימות קטנות ורקמות שקשה במיוחד לחלץ, כגון מיצוי של RNA כולל מעור ארנב ומרקמת חיבור של בעלי חיים;בנוסף, Trizol, כמגיב תמוגה לשימוש כללי, יכול לשמש גם למיצוי של רקמות צמחיות, חיידקים, פטריות ורקמות אחרות.לרקמות צמחיות המכילות פוליסכרידים ופוליפנולים, כמו קמליה אוליפרה, עלי תה, לפתית ועוד, ניתן להשתמש בשיטת CTAB גם להפקת RNA כולל.
כשיטה קונבנציונלית, שיטת העמודים הכפולים פופולרית מאוד גם בשל פעולתה הרגילה בטמפרטורה, אין צורך להוסיף RNase ובטיחות - ללא כלורופורם, פנולים וריאגנטים אורגניים אחרים למיצוי.(מוצרים מומלצים )
2. מיצוי של RNA כולל מרקמות בעלי חיים
(1) השתדלו לבחור רקמה טרייה, אם היא לא טריה (רצוי תוך שלושה חודשים - מקרר 80 ℃ או קפואה בחנקן נוזלי. כאשר חותכים רקמות, אין לחתוך ישירות בטמפרטורת החדר, הקפידו לשים אותה על קופסת הקרח, השתדלו להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת.
(2) השתמש במספריים נקיות ובפינצטה כדי לחתוך פיסת רקמה קטנה, נסה לחתוך את החלק המרכזי של הרקמה בעת חיתוך הדגימה, או חתוך תחילה את פיסת הרקמה הגדולה מהאמצע, ולאחר מכן חתוך את הדגימה במיקום החתך הטרי.יש לגרוס את הרקמה שהוסרה במלואה, להכניס את הרקמה המגוררת לתוך שפופרת EP ללא RNase, להוסיף את ה-lysate, הרקמה המגוררת צריכה להיחשף במלואה ל-lysate ולהתכונן להומוגניזציה.
(3) עבור רקמות רגילות, בחר רקמות בגודל שעועית מונג (30-60 מ"ג) להומוגיזציה.אם הרקמות מכילות כמות גדולה של חלבון, שומן או רקמות סיביות צפופות כמו כבד, הגדל או הקטנת כראוי את כמות הרקמות החתכות (אופציונלי) בחר 10~20 מ"ג).
(4) אם חולצים שרירי דגים, בשר שרימפס, מדוזות ורקמות אחרות עם תכולת מים גבוהה, יש להגדיל את נפח הדגימה בצורה מתאימה (מומלץ 100-200 מ"ג).
(5) אם התנאים מאפשרים זאת, ניתן לחלץ את רקמת החיה ישירות לאחר הומוגנית באמצעות הומוגנית רקמה בעלת מעבר גבוה, אם אין ציוד כזה.
(6) יש להניח את ה-RNA המתקבל לאחר המיצוי הסופי על קופסת הקרח באופן מיידי כדי להפחית את הפירוק של ה-RNA.
3. מיצוי RNA של תאי בעלי חיים
(1) תאי השעיה: צנטריפוגה ישירות והשליך את המדיום, שטף עם PBS סטרילי 1-2 פעמים, ולאחר מכן השהה עם כמות מתאימה של PBS, ולאחר מכן הוסף lysate עבור תמוגה.אין להוסיף את הליזאט ישירות לתאים המשקעים לאחר השלכת הנוזל לחלוטין.זה יגרום לחבילת ההיסטון המשתחררת לאחר התאים המוליזים בשכבה החיצונית להיצמד לחלק החיצוני של התאים המשקעים, ובכך להגביל את המגע של התאים בתוך הכדור עם הליסט., וכתוצאה מכך תמוגה לא מלאה של תאים ותפוקת RNA מופחתת.
(2) תאים דביקים למחצה או לא נצמדים בחוזקה: לאחר השלכת המדיום יש לשטוף עם PBS 1-2 פעמים, ולאחר מכן לספוג ישירות כמות מתאימה של PBS ולנשוף את צלחת התרבית עם פיפטה או אקדח כדי לפוצץ את התאים, ולהעביר אותם לתאים ללא RNA.הוסף את lysate לצינור EP של האנזים לחילוץ.
(3) תאים נצמדים: יש לעכל תחילה עם טריפסין, ואז לאסוף לתוך צינורות EP ללא RNase, לצנטריפוגה כדי להסיר את הסופרנטנט, לשטוף 1-2 פעמים עם PBS כדי להסיר עודף טריפסין, ולהשהות מחדש עם כמות מתאימה של PBS ואז המשך לשלב המיצוי.
4. מיצוי RNA צמחי
רקמות הצמח עשירות בתרכובות פנוליות, או עשירות בפוליסכרידים, או מכילות כמה מטבוליטים משניים לא מזוהים, או בעלות פעילות גבוהה של RNase.חומרים אלה משולבים בחוזקה עם RNA לאחר תמוגת התא ליצירת קומפלקסים בלתי מסיסים או משקעים קולואידים, שקשה להסירם.לכן, כאשר אנו מחלצים רקמת צמחים, עלינו לבחור ערכה לצמחים.הליזאט בערכה יכול לפתור ביעילות את הבעיות של חמצון קל של פוליפנולים והפרדה של תרכובות פוליסכרידים וחומצות גרעין.
(עבור מיצוי RNA של צמח פוליסכריד פוליפנול, מוצרים מומלצים:
(1) יש לטחון את הקליפה, העיסה, הזרעים, העלים וכו' של הצמח במלואו במכתש.במהלך תהליך הטחינה, יש למלא חנקן נוזלי בזמן כדי להימנע מהמסת המדגם.יש להוסיף במהירות את המדגם הטחון ל-lysate ולנער כדי למנוע פירוק RNA.
(2) עבור דגימות עשירות בסיבים כגון עלי אורז וחיטה, יש להפחית כראוי את כמות המיצוי, אחרת טחינת הרקמה והתמוגגת לא תהיה מלאה, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה של RNA מופק.
(3) עבור רקמות צמחיות בעלות תכולת מים גבוהה, כגון פרי רימון, פרי אבטיח, פרי אפרסק וכדומה, יש להגדיל את גודל הדגימה כראוי (100-200 מ"ג הוא אופציונלי).
(4) לרוב מומלץ לרקמות צמחיות, כגון עלי צמחים, קני שורש, פירות קשים וחומרים אחרים להשתמש בחנקן נוזלי כדי לכתש היטב את המרכיבים במכתש, ולאחר מכן להמשיך לשלב המיצוי.הומוגניי רקמות קונבנציונליים עשויים שלא להיות יעילים בהומוגנית רקמות צמחיות, ובדרך כלל אינם מומלצים.
5. אמצעי זהירות למיצוי RNA
(1) דגימות רקמות צריכות להיות טריות ככל האפשר כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות.
(2) הרקמה צריכה להיות טחינה במלואה במהלך החילוץ, וכמות הרקמה לא צריכה להיות קטנה מדי, שלא לדבר על יותר מדי.
(3) יש לתת זמן דגירה מספיק לאחר הוספת ה-lysate לליזה מלאה של הדגימה.
(4) כאשר משתמשים בשיטת טריזול למיצוי, עקרון ספיגת הסופרנטנט לאחר הריבוד הוא "העדיף לשאוף פחות מאשר לשאוף יותר", ואסור לחלץ לשכבה האמצעית, אחרת זה יגרום לזיהום DNA גנומי חמור.
(5) בעת הכביסה, נוזל הכביסה צריך להסתנן במלואו סביב דופן הצינור כדי להבטיח כביסה יסודית.
(6) לשיטת מיצוי העמודים, בנוסף לניתוק העמוד לאחר הכביסה, יש להניח את עמוד הספיחה גם בספסל נקי במיוחד ולפוצץ במשך 5-10 דקות לאידוי מלא של הממס האורגני עד לייבוש.
(7) בגליון האחרון של שיטת העמודים, לאחר הוספת מי DEPC, יש להדגיר אותם במשך 3-5 דקות, או לחמם את מי ה-DEPC ל-60 מעלות צלזיוס מראש כדי להגדיל את תפוקת הגלישה.בשיטת המחשוף המסורתית של Trizol ושיטת המשקעים באיזופרופנול, ה-RNA הסופי מומס במי DEPC, ולכן יש לתת זמן מתאים לפירוק, ויש לפוצץ את החלק התחתון של צינור הצנטריפוגה ברציפות עם קצה פיפטה.
3 Tשלוש סיבות ופתרונות לריכוז RNA נמוך/איכות ירודה
1. התשואה נמוכה מדי
הדגימה שחולצה נמוכה מדי, הכמות הכוללת אינה מספקת, או שהדגימה שחולצה גדולה מדי וההתמוגה לא הושלמה;יש להשתמש ברקמה או בתאים באיכות המתאימה לצורך מיצוי, הטיפול המקדים בדגימה חייב להיעשות היטב, והליסיס צריך להיות מספיק.
2. שאריות הגנום
בעת מיצוי בשיטת Trizol, כאשר הסופרנטנט נשאב לשכבה האמצעית לאחר השכבה, ייגרם זיהום גנום חמור;יש לנקוט משנה זהירות בעת השכבה כדי למנוע יניקה לשכבה האמצעית.אם נעשה שימוש בשיטת העמודה לחילוץ, ניתן לבחור ערכה המכילה DNase I לחילוץ.חומצת הגרעין הנספגת על הממברנה מתעכלת ישירות עם DNase I, מה שיכול להפחית מאוד את שאריות ה-DNA.
3. פירוק RNA
זה יכול להיות השפלה של הדגימה המופקת עצמה, או השפלה שנגרמה במהלך תהליך המיצוי;ככל שניתן, יש להשתמש בדגימות טריות למיצוי RNA, ואת הדגימות שנאספו יש לאחסן בחנקן נוזלי או במקרר -80 מעלות צלזיוס בזמן, ולהימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.יש להשתמש בטיפים ללא RNase/DNase, צינורות צנטריפוגות וחומרים אחרים בתהליך מיצוי ה-RNA.תהליך החילוץ צריך להיות מהיר ככל האפשר.יש להניח את ה-RNA המופק על קופסת קרח ולאחסן בזמן -80.אם צריך לזהות את ה-RNA המופק על ידי אלקטרופורזה ג'ל, יש לבצע אלקטרופורזה מיד לאחר המיצוי, ולהחליף את חיץ האלקטרופורזה במאגר שהוכן לאחרונה.
4. מלח ושאריות ממסים אורגניים
ריאגנטים המיצוי מכילים מלחי פנול וגואנידין, ותמיסת הכביסה מכילה אתנול.במהלך תהליך המיצוי, הליזאט לא נספג לחלוטין והושלך, ותמיסת הכביסה לא התייבשה במלואה.שאריות מלחים וממיסים אורגניים מזיקים לשעתוק הפוך ול-PCR שלאחר מכן.דרגות שונות של עיכוב, לכן יש להסיר את הליזאט הרקמה במלואו במהלך תהליך המיצוי, והשטיפה צריכה להספיק כדי שניתן יהיה לשטוף את הקירות שמסביב לצינור.בנוסף, הצינור מתרוקן וניפוח הוא שלב הכרחי, שיפחית עוד יותר את שאריות החומר האורגני.
למידע נוסף על מיצוי RNA, אנא עקוב אחר האתר שלנו:
www.foreivd.com למידע נוסף.
זמן פרסום: דצמבר-01-2022
